Apr 18, 2022
Protocolo Tcg4
- 1Universidad Autónoma del Estado de México
Protocol Citation: dgalvana 2022. Protocolo Tcg4. protocols.io https://dx.doi.org/10.17504/protocols.io.8epv59nq5g1b/v1
License: This is an open access protocol distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited
Protocol status: Working
We use this protocol and it’s working
Created: April 18, 2022
Last Modified: April 18, 2022
Protocol Integer ID: 60953
Abstract
Protocolo para realizar PCR de Tcg4
Materials
Material
*Micropipetas
*Puntas para PCR
*Tubos para PCR
*Gradilla
*Termociclador
Reactivos
*Agua libre de nucleasas
*DNA
*Buffer 10x plus Mg
*dNTPs
*Primers
F1 5´TAA TAC GAC TCA TAG GGA3'
R4 5´TAG AAG GCA CAG TCG AGG CT3´
*Taq polimerasa
Protocolo de Tcg4
Protocolo de Tcg4
NOTA: Antes de comenzar es recomendable preparar la reacción sobre hielo. Todos los materiales deben estar estériles y limpios. Todo el procedimiento debe ser llevado a cabo dentro de la campana negra (previamente limpia con solución agua: cloro y esterilizada con UV durante 15 min)
Prepare los tubos que habrá de utilizar para su PCR en una gradilla. NOTA: Preferentemente NO etiquete la tapa del tubo ya que se puede borrar, mejor etiquete en los costados
Realice los cálculos de para preparar las reacciones necesarias (En este caso son 5 reacciones cada una con su control correspondiente, en total 10).
Agregue cada componente de la tabla 1 en orden descendente en un tubo y marque como MasterMix (no agregar ADN ni primers). NOTA: coloque la polimersa al final. Saque del congeador la enzima y regresela inmediatamente después.
TABLA 1: Reactivos para PCR MasterMix
| Reactivos | Una reacción | 10 reacciones | |
| Agua libre de nucleasas | 40.75 μL | 407.5 μL | |
| Buffer 10x plus Mg | 5 μL | 50 μL | |
| dNTPs | 1 μL | 10 μL | |
| Taq polimerasa | .25 μL | 2.5 μL |
- Se empelo el Kit PCR Reagent System
| Primers | 2.5μL (1.25 μL de c/u) | |
| ADN molde | .5 μL |
Coloque la cantidad correspondiente del MasterMixa cada uno de los tubos (47μL).
Posteriormente coloque en cada tubo los primers y el ADN ha utilizar (volumen total de cada tubo 50 μL) NOTA: A los controles negativos no coloque ADN, en su lugar agregue agua libre de nucleasas.
Coloque los tubos en el termociclador ya programado con las condiciones de la PCR (ver tablas abajo).
Condiciones del Termociclador
| A | B | C | |
| Pasos | Temperatura | Tiempo | |
| Desnaturalización inicial | 94 OC | 3min | |
| Desnaturalización | 94 OC | 45s | |
| Hibridación | 53 OC | 30s | |
| Extensión | 72 OC | 1 min | |
| Incubación final | 72 OC | 10min | |
| 4 OC | infinito | ||
| 30 ciclos |
Al terminar su PCR analice su producto en electroforesis.