Feb 09, 2020
Version 3
MICRO-DILUCIÓN EN PLACA PARA LA EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA EN 50 uL V.3
- Germán Alberto Téllez Ramírez1,
- Lily Johanna Toro2,
- Juliana Franco Castrillon3,
- Diana Carolina Henao1,
- Jhon Carlos Castaño Osorio3,
- Grupo De Inmunología Molecular GYMOL Universidad Del Quindio3
- 1Centro de Investigaciones Biomédicas;
- 2Centro de Investigaciones Biomédicas - Universidad del Quindío;
- 3Centro de Investigaciones Biomédicas - Universidad del Quindío - Colombia
Protocol Citation: Germán Alberto Téllez Ramírez, Lily Johanna Toro, Juliana Franco Castrillon, Diana Carolina Henao, Jhon Carlos Castaño Osorio, Grupo De Inmunología Molecular GYMOL Universidad Del Quindio 2020. MICRO-DILUCIÓN EN PLACA PARA LA EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA EN 50 uL . protocols.io https://dx.doi.org/10.17504/protocols.io.8xmhxk6
Manuscript citation:
- O'Brien J, Wilson I, Orton T, Pognan F. 2000. Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity. Eur J Biochem. 2000 Sep; 267(17):5421-6. T e c h n i c a l B u l l e t i n. CellTiter-Blue® Cell Viability Assay. Promega. INSTRUCTIONS FOR USE OF PRODUCTS G8080, G8081 AND G8082.
- Wiegand I, Hilpert K, Hancock RE. Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances. 2007. Nat Protoc. 2008;3(2):163-75. doi: 10.1038/nprot.2007.521.
License: This is an open access protocol distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited
Protocol status: Working
We use this protocol and it's working
Created: November 01, 2019
Last Modified: February 09, 2020
Protocol Integer ID: 29389
Keywords: antimicrobial, peptides, compounds, fluorescence,
Abstract
Este método es basado en el método clásico de micro-dilución en placa de NCLSS (National Committee of Laboratory Safety and Standards (NCLSS) como fue publicado en Amsterdam, D. 1996. Susceptibility testing of Antimicrobials in liquid media. In 'Antibiotics in Laboratory Medicine', Lorian, V., ed. Fourth Edition, pp.52-111. Williams and Wilkins, Baltimore.
Modificado con respecto a la lectura de la placa utilizando un indicador metabólico para incrementar la sensibilidad de la prueba respecto al crecimiento de las bacterias.
La realizacion de este protocolo fue posible gracias al apoyo del departamento administrativo de ciencia tecnología e innovacion, Colciencias a traves del proyecto 111356933173 convocatoria569-2012.
Este protocolo fue estandarizado con el desarrollo del proyecto de grado "OPTIMIZACIÓN DE UN MÉTODO PARA EVALUAR LA ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA IN VITRO EN MICROVOLÚMENES" de la estudiante Juliana Franco para optar por el titulo de Biologa.
Guidelines
El siguiente procedimiento consta del crecimiento de las bacterias, preparacion de la muestra, dilucion de las bacterias, incubacion lectura y analisis.
Tiempo estimado 3 días contando la descongelación de las bacterias.
La lectura se puede realizar por turbidez, Absorbancia libre o con resazurin; o fluorecencia de resorufin.
Materials
MATERIALS
resazurinAcros OrganicsCatalog # 189900050
96-well microtiter plates polypropilenegreiner bio-oneCatalog #650201
Mueller HintonscharlauCatalog #02-136
Safety warnings
Maneje todas las normas de bioseguridad microbiológica dependiendo de la muestra y la bacteria a utilizar (cepas de referencia, aislados clínicos, patogénicos).
Before start
Medio de cultivo Muller Hinton líquido (15mL por placa aprox)
Medio de cultivo Mueller Hinton Agar (1 plato por bacteria a evaluar)
Resazurin 440 µM (10X): tome 0.011g de resazurin y lleve a 100mL en agua destilada, mezcle en frasco ámbar, filtre por 0.22µm y guarde oculto de la luz 4ºC. (absorbancia máxima resazurin=603nm; absorbancia máxima resorufin=570nm) (excitación 579/Emisión 584)
Antibiótico como control positivo. (Antibiótico antimicótico de cultivo celular 100X= penicilina 10000 unidades/ml streptomicina 10000unidades /mL)
Muestras péptido a evaluar para compuestos puros generalmente se trabajan desde concentraciones finales de 100 µg/mL.
Preparación de las bacterias
Preparación de las bacterias
Tome las bacterias a evaluar del banco de células y siga el protocolo de descongelación (siembre en placas de medio selectivo e incube a 37°C por 12-24 horas)
Inocule una de las colonias de las bacterias a evaluar en tubos conicos de 15ml con de 2-5ml de caldo de cultivo Muller Hinton y lleve a 37°C en agitación a 180 rpm deje crecer por 5-8 horas aprox.
12:00:00 incuba bacterias
05:00:00 crecimiento inóculo
Preparación de la muestra
Preparación de la muestra
Diluya el péptido a una concentración 10 veces más alta con respecto a la concentración máxima a evaluar (solución stock del péptido).
Realice diluciones seriadas de la solución stock del péptido en agua estéril o medio de cultivo, según corresponda a las diluciones del péptido que se quieren evaluar.
Adicione 5 µL de cada una de las diluciones del péptido en cada uno de los pozos correspondientes (columnas 1-10).
Adicione 50 µL de medio Mueller Hinton a la columan 11 como control de medio y 45 µL a las filas D y G como control de esterilidad del compuesto.
00:40:00 por placa
Dilución de las bacterias
Dilución de las bacterias
Tome las bacterias crecidas en el paso 1 y diluya o deje crecer hasta alcanzar una concentración aproximada de 3-6 por 10 a la 8 UFC, lo cual corresponde a una densidad óptica (O.D) de 0,2 a 0,4 a una longitud de onda de 600 nm en celda de 1 cm ó a una O.D de 0,1 a 570 nm en 100 µL en placa de ELISA de 96 pozos.
Tome las bacterias del paso anterior y diluya 1:1000 en medio líquido Muller Hinton para llevar a una concentración de 3-5 por 10 a la 5 UFC (solución de trabajo de bacterias)
Adicione 45 µL de la solución de trabajo de bacterias a todos los pozos de la placa de microtitulación menos fila D, H y columna 11 como se indica en la Tabla 1.
Tabla 1
| µg/ml | 250 | 125 | 62,5 | 31,25 | 15,62 | 7,81 | 3,91 | 1,95 | 0,98 | 0,49 | C- | C+ | ||
| Replicas | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | ||
| Replica 1 de cada tratamiento | A | |||||||||||||
| Replica 2 de cada tratamiento | B | |||||||||||||
| Replica 3 de cada tratamiento | C | |||||||||||||
| Ctrl esterilidad péptidos | D | |||||||||||||
| Replica 1 de cada tratamiento | E | |||||||||||||
| Replica 2 de cada tratamiento | F | |||||||||||||
| Replica 3 de cada tratamiento | G | |||||||||||||
| Ctrl esterilidad péptidos |
Deje incubar por 12-16 horas (crítico: no más de 16 horas) a 37ºC sin agitación.
00:30:00 adicionar bacterias
13:00:00 incubación placa
Análisis
Análisis
Para leer por turbidimetria lea la absorbancia a 570nm
Para leer por Absorbancia con resazurina: adicione 5 µL de solución de rezasurina a 440µM para una concentración final de 44 µM en cada pozo
Incube por 2 horas a 37°C
Lea las placas en espectrofotómetro a 570 y 603nm
Realizar delta: por cada pozo reste la absorbancia de 570nm menos 603 nm
Delta = A570nm-A603nm
A partir del grupo de datos del delta calcula:
Blancos: calcula la mediana del grupo de blancos C- (medio de cultivo).
Blanco = Mediana (11A:11C)
Reste el blanco a los valores del delta de cada pozo
A partir del grupo de datos del delta menos el blanco calcula:
Creminiento de bacterias: calcula la mediana del grupo de crecimiento de bacterias C+.
ControlBacterias= Mediana(12A:12C)
A partir de estos valores calcula el porcentaje de crecimiento de cada pozo haciendo una relacion directa.
%Crecimiento= (X/Control de bacterias)*100
X= Valor de delta menos el blanco de cada pozo.
Para leer por Fluorescencia
Adicione resazurina a concentración final de 44 µM.
Deje incubar por 90 minutos
Lea la placa ext/emisión 579/584 (filtros ext 565/10; em 600/40)
Tome los valores de fluorescencia y calcula:
Blancos: calcula la mediana del grupo de blancos C- (medio de cultivo).
Blanco = Mediana (11A:11C)
Resta el valor del blanco a todos lo pozos.
Crecimiento de bacterias: calcula la mediana del grupo de crecimiento de bacterias C+.
ControlBacterias= Mediana(12A:12C)
A partir de estos valores calcula el porcentaje de crecimiento de cada pozo haciendo una relacion directa.
%Crecimiento= (X/Control de bacterias)*100
X= Valor fluorescencia menos el blanco
Fig 1. Microdilución en placa de 96 pozos después de 2 horas de incubación con la resazurina. Columnas 1A-1C a 10A-10C (molecula a evaluar, desde la concentración más alta (100ug/mL) hasta (0,19ug/mL). Columnas 11A-11C (control de esterilidad del medio), columnas 12A-12C (control de viabilidad bacteriana). fila D1-D12 (control de esterilidad de la molecula evaluada)
Dataset
Microdilución
NAME
CBM
CBM
Para calcular la concentración bactericida mínima (C.B.M)
Tome 10 µL de hasta 3 concentraciones por triplicado sin crecimiento viable y siembre en platos de agar mueller Hinton.
Incube por 18 a 24 h a 37°C y cuente las colonias
La C.B.M es considerada como la concentración más baja que previene la formación de colonias residuales (fig 2)
Figura 2. Caja de petri con agar Muller Hinton, en donde la concentración bactericina minima (CMB) es 1,95 ug/mL.