Jun 27, 2023
Electroforesis de proteínas y Western blot DENV
- 1Corporación Universitaria Empresarial Alexander von Humboldt;
- 2Corporacion Universitaria Empresarial Alexander von Humboldt
Protocol Citation: Delia Piedad Recalde-Reyes, Juliana Lopez Calderon 2023. Electroforesis de proteínas y Western blot DENV. protocols.io https://dx.doi.org/10.17504/protocols.io.kxygx963dg8j/v1
License: This is an open access protocol distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited
Protocol status: Working
We use this protocol and it's working
Created: May 03, 2023
Last Modified: June 27, 2023
Protocol Integer ID: 81380
Funders Acknowledgement:
Ministerio de Ciencia Tecnología e Innovación Minciencias
Grant ID: Convocatoria Minciencias 917 de 2022
Abstract
Una prueba tipo Western Blot (también conocida como inmunotransferencia) es una técnica utilizada para detectar proteínas específicas en una muestra. El procedimiento consiste en separar las proteínas de la muestra en función de su tamaño mediante la técnica de electroforesis para luego ser transferida a una membrana de polivinilo.
La membrana se somete a una serie de pasos de bloqueo y lavado para eliminar las proteínas no específicas y prevenir la unión no específica de anticuerpos en la muestra. Se añade un primer anticuerpo específico que se unen a la proteína de interés y un anticuerpo secundario que se une al anticuerpo primario.
Finalmente, se utiliza un sustrato químico que reacciona con el anticuerpo secundario para producir una señal visual que indica la presencia de la proteína de interés. La intensidad de la señal visual está relacionada con la cantidad de proteína presente en la muestra.
Este protocolo fue desarrollado gracias al apoyo administrativo de la CUE Alexander von Humboldt de Armenia y desarrollado dentro de la convocatoria de Minciencia 917 de estancia en investigación: Desarrollo de una prueba tipo Western blot, Dot blot e Inmunofluorescencia para detección de antígenos virales de dengue serotipos 1 – 4.
Guidelines
El siguiente protocolo describe el paso a paso para la realización de una prueba tipo Wester Blot para detección de dengue virus.
Tiempo de duración horas a partir de la realización del gel de electroforesis.
Materials
Acrilamida bis acrilamida 40%.
1.5M Tris HCl pH 8.8.
SDS 10%.
Agua destilada.
TEMED.
Persulfato de amonio 10%.
Metanol absoluto
Glicerol al 50%.
Azul de bromofenol al 1%.
PBS (Buffer fosfato salino) con tween al 0,05%
Cámara de proteínas.
Membrana de polivinilo , 0,45 μm, 30 cm x 3 m Santa Cruz Polivinilo Cat. SC-3723
Micropipetas 0,1-10; 10-100ul
Balanza analítica.
Safety warnings
Implementar todas las medidas de bioseguridad para trabajo en el laboratorio. Utilizar guantes, bata y cabina de bioseguridad tipo II, manejar todos los reactivos y suplementos de forma aséptica para garantizar cultivos axénicos libres de microorganismos.
Utilizar alkazime para inactivar los desechos que se generen en el procedimiento tales como virus, células cancerígenas, aislados clínicos o cualquier otro biológico que cause daño a la salud.
Before start
Preparar todos los medios y reactivos necesarios para usar en el inmunoensayo. Asegúrese de contar con la candad suficientes para cada uno de los pasos.
Gel de electroforesis de proteínas (Denaturante) al 10% (Volumenes suficientes para 2 geles)
Preparar gel de resolución empleando
Acrilamida bis acrilamida 40% 2.5 mL
1.5M Tris HCl pH 8.8 2.5 mL
SDS 10% 100 µL
Agua destilada 4.845 mL
TEMED 5 µL
PSA 10% 50 µL
VOLUMEN TOTAL 10 mL
Después de adicionar los reactivos en la cámara de proteínas puede adicionarse 300 µL de metanol absoluto para favorecer la polimerización del gel.
Note
- El persulfato de amonio (PSA) debe diluirse en agua destilada y preparar fresco siempre antes de usar. No se recomienda emplear persulfato refrigerado o congelado.
- Adicionar los reactivos en el orden que se muestran, se recomienda adicionar el TEMED Y PSA al 10% al finalizar la mezcla.
- Evitar la formación de burbujas de aire. La reacción se da en ausencia de oxígeno.
Gel de empaquetamiento (staking) al 4% (Volumenes suficientes para 2 geles)
Acrilamida bis acrilamida 40% 0.5 mL
1.5M Tris HCl pH 6.8 1.25 mL
SDS 10% 50 µL
Agua destilada 3.160 mL
TEMED 5 µL
PSA 10% 25 µL
VOLUMEN TOTAL 5 mL
Note
Geles de resolución de acuerdo con el peso de las proteínas
Porcentaje Acrilamida Rango de separación KDa
5 60 - 210
7.5 35 - 95
10 15 - 70
15 4 - 200
Correr el gel a 80 voltios( 8 voltios por cada cm de gel ) hasta que termine la corrida en el gel de empaquetamiento.
Posteriormente correr entre 12 a 15 voltios por cm de gel (entre 120 a 150 voltios) durante 60 minutos.
Si esta corriendo un gel a 30mAmp y para 2 geles 60mAmp.
Preparación de la muestra
Preparación buffer carga 2X
SDS al 10% 6 mL
Glicerol al 50% 15 mL
Azul de bromofenol al 1% 0.3 mL
0.5 M Tris HCl pH 6.8 3.75 mL
Agua destilada ajustar a 30mL
Adicionar B mercaptoetanol a 950 µL de muestra antes de usar.
Protocolo tomado y adaptado de BioRad.
Adicion buffer carga a la muestra
Para 10 µL de muestra añadir:
5 µL de muestra (entre 5 µg a 10 µg de proteína total para un minigel o determinar concentración de proteínas por BCA.
4.75 µL de buffer carga
0.25 µL de betamercaptoetanol
Total muestra 10 µL
Calentar muestra 90 °C -100 °C durante 00:05:00 5 minutos ó a 70 °C durante 00:10:00 10 minutos
Cargar muestra a cada pozo 10 µL
Note
Se puede cargar entre 40 40 µg a 60 µg de muestras con proteína total no pura (antígeno total) y entre 0.5 µg a 4 µg de proteínas puras.
En caso de necesitar diluir las muestras de proteína total puede hacerse empleando PBS 1X.
15m
Transferencia semi seca de proteínas
Buffer de transferencia 1L
3.029 g de Tris Base
14.263 g de glicina
Diluir empleando agua destilada, ajustar volumen hasta 700 mL
Verificar pH a 8.3 o ajustar hasta alcanzar un volumen de 800 mL
Llevar a 1000 mL empleando 200 mL de metanol absoluto.
Para realizar la transferencia del gel de proteinas a la membrana se debe hidratar previamente la membrana sumergiendola durante 00:05:00 5 minutos en metanol absoluto, posterior a esto poner en contacto la membrana de polivinilo con el gel de electroforesis.
Eliminar las burbujas restantes entre gel membrana
Tanto gel como membrana deben ponerse sobre papel filtro BioRad Cat. 1703960
El papel filtro debe sumergirse previamente en buffer de transferencia a 4 °C durante 00:05:00 5 minutos
El orden de los elementos debe ser el siguiente desde la parte superior hasta la inferior
Papel filtro
Gel
Membrana de polivinilo 0.45um
Papel filtro
La trasferencia se realiza en equipo trans tubo blot de BioRad empleando el protocolo éstandar preestablecido para 2 mini geles
25 voltios - 1.0A - 00:30:00 30 minutos
Note
Para verificar la transferencia del gel a la membrana, puede realizarse coloración de la misma empleando rojo Ponceau. La coloración de rojo de ponceau se prepara empleando 0.25g de rojo de ponceau, 15 mL de acido acético llevar a 60mL de volumen disuelto en agua destilada, emplear 40mL de metanol (0,25% P/V rojo Ponceau en 15% V/V ácido acético y 40% V/V metanol)
Esta coloración es rápida, no es permanente, no afecta ensayos posteriores y se elimina fácilmente lavando la membrana al emplear agua destilada.
40m
Bloqueo membrana de PVDF
Cada membrana sensibilizada fue bloqueada Overnight empleando leche descremada al 5%, disuelta en TBS-T.
Note
La membrana debe quedar sumergida en su totalidad en solución de bloqueo, el lado liso debe ir hacia abajo preferiblemente.
Adición anticuerpo primario
Se emplearon sueros de origen humano previamente determinados por kit comerciales como
Positivos para DENV y Negativos para DENV.
Estos anticuerpos fueron diluidos 1:200 empleando solución de bloqueo.
La reacción fue incubada durante 02:00:00 2 horas a temperatura ambiente 20 °C en agitación constante 120rpm.
2h
Lavados
Se realiza lavado de la membrana con 5 mL de TBS-Tween-0,05% (TBS-T) por 00:05:00 5 minutos , este proceso se repite tres veces.
5m
Anticuerpo secundario
El anticuerpo secundario (Anti human Sigma Cat. A8542) fue diluido 1:5000 en TBS-T con azida de sodio (NaN3) al 0,03%.
Note
El anticuerpo secundario debe ser desechado posterior a su utilización.
Para asegurarse de la eliminación de residuos de leche descremada la membrana puede lavarse empleando agua destilada.
Lavados
Se realiza lavado de la membrana con 5 mL de TBS-Tween-0,05% (TBS-T) por 00:05:00 5 minutos , este proceso se repite tres veces.
5m
Para revelar la reacción se empleó sustrato (BCIP/NBT) Thermo Scientific Ref: 34042, la reacción se incubó a 37 °C durante 00:05:00 5 minutos .
La reacción se detuvo empleando agua destilada.
Las membranas se secaron a temperatura ambiente por 00:05:00 5 minutos .
10m
Lectura de los resultados