Sep 02, 2023
DOT BLOT - DENGUE VIRUS
- 1Corporación Universitaria Empresarial Alexander von Humboldt;
- 2Corporacion Universitaria Empresarial Alexander von Humboldt
Protocol Citation: Delia Piedad Recalde-Reyes, Juliana Lopez Calderon 2023. DOT BLOT - DENGUE VIRUS. protocols.io https://dx.doi.org/10.17504/protocols.io.bp2l696jdlqe/v1
License: This is an open access protocol distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited
Protocol status: Working
We use this protocol and it's working
Created: April 17, 2023
Last Modified: September 02, 2023
Protocol Integer ID: 80600
Funders Acknowledgement:
Minciencias Convovatoria 917 de 2022
Grant ID: convocatoria 917 de 2022 Minciencias
Abstract
Es un inmunoensayo simple y rápido. Requiere la aplicación de una pequeña cantidad de muestra directamente sobre una membrana polivinilo PVDF, en la que se deposita antigeno total de DENV y posteriormente se expone a suero humano diluido en TBS-T 1:200, para posteriormente, ser detectado con anticuerpo IgG anti human marcado con fosfatasa alcalina diluido en TBS-T (1:5000).
La reacción se visualiza a simple vista al visualizar la presencia de un punto de color violeta (reactivo o positivo) o la ausencia de este (no reactivo o negativo).
Este protocolo fue desarrollado gracias al apoyo administrativo de la CUE Alexander von Humboldt de Armenia y desarrollado dentro de la convocatoria de Minciencia 917 de estancia en investigación: Desarrollo de una prueba tipo Western blot, Dot blot e Inmunofluorescencia para detección de antígenos virales de dengue serotipos 1 – 4.
Guidelines
El siguiente protocolo describe el paso a paso para la realización de una prueba tipo Dot Blot para detección de dengue virus.
Tiempo de duración 24 horas a partir de la activación de las membranas de polivinilo.
Materials
Membrana de polivinilo , 0,45 μm, 30 cm x 3 m Santa Cruz Polivinilo Cat. SC-3723
Micropipetas 0,1-10; 10-100ul
Balanza analítica.
TBS- T (Buffer tris salino) con tween al 0,05%
PBS (Buffer fosfato salino) con tween al 0,05%
Agua destilada
Leche descremada en polvo disuelta en TBS-T al 5%
Sueros humanos diluidos 1:200 en TBS-T
Antihuman IgG marcado con fosfatasa alcalina Sigma Aldrich Ref: A8542
Sustrato fosfatasa alkalina (BCIP/NBT) Thermo Scientific Ref: 34042
Safety warnings
Implementar todas las medidas de bioseguridad para trabajo en el laboratorio. Utilizar guantes, bata y cabina de bioseguridad tipo II, manejar todos los reactivos y suplementos de forma aséptica para garantizar cultivos axénicos libres de microorganismos.
Utilizar alkazime para inactivar los desechos que se generen en el procedimiento tales como virus, células cancerígenas, aislados clínicos o cualquier otro biológico que cause daño a la salud.
Before start
Preparar todos los medios y reactivos necesarios para usar en el inmunoensayo. Asegúrese de contar con la candad suficientes para cada uno de los pasos.
Preparación del antígeno
En este ensayo se trabajó con antígeno total de DENV2; el virus esta previamente titulado a 17.000.000 UFP/mL y almacenado a -80 °C .
Previo al uso del antígeno total, este se llevó a temperatura ambiente de manera espontánea.
Estos virus fueron empleados como antígeno total para los ensayos de Dot Blot.
Después de su descongelación, estas alicuotas fueron almacenadas a -20 °C .
Note
Estos antígenos no pueden ser utilizados para ensayos como plaqueos o infecciones (únicamente como antígeno total).
Activación membrana de polivinilo
Para realizar este paso es necesario sumergir la membrana de polivinilo poro 0,45μm en metanol absoluto durante 00:05:00 5 Minutos .
Posteriormente se retira y se deja secar a temperatura ambiente.
Note
Las membranas de PVDF de Santa Cruz, tienen un lado porozo y uno lado liso, de acuerdo con las indicaciones del fabricante se debe trabajar sobre el lado liso.
5m
Adición del antígeno total sobre la membrana (transferencia directa)
En la membrana de polivinilo se aplica 1 µL de metanol absoluto, empleando una micropipeta de 10μm.
Sobre este punto se añaden 3 µL de antígeno total (DENV).
Esta muestra se deja secar a temperatura ambiente durante 00:10:00 10 minutos .
10m
Bloqueo de la membrana
Cada membrana sensibilizada fue bloqueada Overnight empleando leche descremada al 5%, disuelta en TBS-T.
Note
La membrana debe quedar sumergida en su totalidad en solución de bloqueo, el lado liso debe ir hacia abajo preferiblemente.
Adición de Anticuerpo Primario
Se emplearon sueros de origen humano previamente determinados por kit comerciales como
Positivos para DENV y Negativos para DENV.
Estos anticuerpos fueron diluidos 1:200 empleando solución de bloqueo.
La reacción fue incubada durante 02:00:00 2 horas a temperatura ambiente 20 °C en agitación constante 120rpm.
2h
Lavados
Se realiza lavado de la membrana con 5 mL de TBS-Tween-0,05% (TBS-T) por 00:05:00 5 minutos , este proceso se repite tres veces.
5m
Anticuerpo secundario
El anticuerpo secundario (Anti human Sigma Cat. A8542) fue diluido 1:5000 en TBS-T con azida de sodio (NaN3) al 0,03%.
Note
El anticuerpo secundario debe ser desechado posterior a su utilización.
Para asegurarse de la eliminación de residuos de leche descremada la membrana puede lavarse empleando agua destilada.
Lavados
Se realiza lavado de la membrana con 5 mL de TBS-Tween-0,05% (TBS-T) por 00:05:00 5 minutos , este proceso se repite tres veces.
5m
Revalado.
Para revelar la reacción se empleó sustrato (BCIP/NBT) Thermo Scientific Ref: 34042, la reacción se incubó a 37 °C durante 00:05:00 5 minutos .
La reacción se detuvo empleando agua destilada.
Las membranas se secaron a temperatura ambiente por 00:05:00 5 minutos .
10m
Figura 1. Resultados visuales Dot blot. A. Resultado negativo B. Resultado positivo
Determinación punto de corte
La interpretación de los datos debe realizarse tomando de la siguiente manera.
Obtener el promedio y desviación estandar de la intensidad de señal de los controles negativos (PBS, o sueros/plasmas) negativos.
Cut off = X̅ + 3 * DS
X̅: Promedio
DS: Desviación estandar
Interpretación
Los valores iguales e inferiores al promedio se consideran NEGATIVOS, valores iguales al promedio + 3 desviaciones estandar se consideran resultados INDETERMINADOS (zona gris de la prueba).
Valores por encima del punto de corte se consideran POSITIVOS.
Note
Nota: La intensidad de señal fue cuantificada empleando el software Fiji https://imagej.net/software/fiji/downloads; siguiendo las indicaciones del fabricante.
Cada determinación se realizó considerando el mismo numero de pixeles y área de medida.