Sep 18, 2023

Public workspaceCyanobacteria growth V.2

DOI
dx.doi.org/10.17504/protocols.io.4r3l22o8xl1y/v2
  • 1UFRJ;
  • 2Universidade Federal do Rio de Janeiro
Ricardo M. Borges
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DOI: dx.doi.org/10.17504/protocols.io.4r3l22o8xl1y/v2
Protocol Citation: Ricardo M. Borges, Gabriela de Assis Ferreira, Fernanda Chagas, Paulo Iiboshi Hargreaves, Fernanda FOC Chagas 2023. Cyanobacteria growth . protocols.io https://dx.doi.org/10.17504/protocols.io.4r3l22o8xl1y/v2Version created by Ricardo M. Borges
License: This is an open access protocol distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License,  which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited
Protocol status: Working
We use this protocol and it's working
Created: September 18, 2023
Last Modified: September 18, 2023
Protocol Integer ID: 87938
Funders Acknowledgement:
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro - FAPERJ
Grant ID: E-26/201.260/2021
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro - FAPERJ
Grant ID: E-26/210.489/2019
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq
Grant ID: 304501/2021-2
Abstract
Este documento tem como objetivo apresentar um protocolo abrangente para o cultivo de cianobactérias em meio aquático salino. O protocolo incorpora informações detalhadas sobre a composição das soluções, cálculos fundamentais e volumes requeridos para a execução bem-sucedida de todo o procedimento. É pertinente ressaltar que as taxas de crescimento podem manifestar consideráveis variações interspecíficas entre as diferentes estirpes de cianobactérias.

Safety warnings
Autoclave:
Proteção Pessoal: Sempre use roupas de proteção adequadas, como avental, luvas, óculos de proteção e calçados fechados ao operar a autoclave.

Condições de Trabalho: Verifique se a área de trabalho está bem ventilada e se possui fácil acesso a chuveiros de emergência e lava-olhos.

Resfriamento: Após a autoclavagem, espere o ciclo de resfriamento antes de abrir a autoclave. A alta pressão e temperatura podem causar explosões se o processo não for concluído corretamente.

Cuidado com o Vapor: Esteja atento ao vapor quente que é liberado quando a autoclave é aberta. Mantenha o rosto e as mãos afastados da abertura.

Manutenção: Certifique-se de que a autoclave esteja em boas condições de funcionamento e tenha passado por manutenção regular.


Substâncias Químicas:

  1. Manuseio Seguro: Use as luvas apropriadas e tome cuidado ao manusear substâncias químicas. Evite contato direto com a pele e os olhos.
  2. Filtragem: Ao usar filtros, siga as diretrizes para descarte seguro de filtros contaminados.
  3. Armazenamento: Guarde todas as substâncias químicas de acordo com as regulamentações de segurança e em áreas designadas para armazenamento de produtos químicos.

Tampões de Algodão:

  1. Manuseio Cuidadoso: Tenha cuidado ao manusear os tampões de algodão e verifique se não há resíduos químicos ou contaminantes presentes neles.
  2. Autoclave com Cuidado: Ao autoclavar os tampões de algodão, siga as instruções de autoclave com cuidado para evitar superaquecimento ou explosões.
  3. Secagem Adequada: Certifique-se de que os tampões de algodão estejam completamente secos antes de usá-los nos frascos Erlenmeyer.


Geral:

  1. Procedimentos Adequados: Siga rigorosamente todas as etapas e procedimentos descritos no protocolo. Não tome atalhos e evite improvisar.
  2. Treinamento: Pessoas que executam esses procedimentos devem ser treinadas em segurança laboratorial e familiarizadas com os riscos associados.
  3. Plano de Emergência: Esteja ciente do plano de emergência do laboratório e saiba como agir em caso de acidentes.
  4. Descarte Seguro: Certifique-se de descartar resíduos químicos e materiais biológicos de acordo com os regulamentos locais e as diretrizes do laboratório.
  5. Documentação: Mantenha registros precisos de todas as etapas realizadas, incluindo datas e detalhes relevantes.

Lembrando que as precauções de segurança podem variar de acordo com as regulamentações locais e o nível de risco associado ao trabalho realizado no laboratório. Portanto, é fundamental consultar as diretrizes de segurança específicas do seu local de trabalho e seguir as melhores práticas de segurança em todos os momentos.
Preparo Anterior ao Cultivo
Preparo Anterior ao Cultivo
A quantidade de frascos Erlenmeyer de 500 mL necessária variará conforme o número de amostras a serem produzidas. Siga o seguinte esquema:
  • X amostras em quintuplicatas (x5)
  • Cepa Controle de Qualidade Externo (CCRM0280) em quintuplicatas (x5)
  • Amostras Branco de Meio de Cultivo(2 frasco Erlenmeyer tratado da mesma forma com meio e nutrientes, mas sem a etapa de inoculação)

Por exemplo: se estivermos comparando 3 espécies diferentes, serão necessários (3*5) + 5 + 2 (=22) frascos no total.


Preenchimento do Arquivo Metadata:
  • Código das amostras
  • Código das cepas
  • Espécie
  • Meios de cultivo
  • Data de início
  • Datas de adição dos nutrientes
  • Data de coleta da biomassa
  • Método de extração (média polaridade: Diclorometano-Metanol)
  • Método de extração 2 (alta-polaridade: Metanol-Água)
  • Comentários

Lembre-se de seguir essas etapas para um registro completo e preciso das informações relacionadas ao experimento.
Material
Material
  • Frascos Erlenmeyer de 500 mL
  • Frascos tipo Scotch de 250 mL e de 1 litro
  • Tubos de centrifuga de 50 mL do tipo Falcon
  • Alças estéreis
  • Reagentes para preparo das soluções estoque (ver abaixo)
  • Centrífuga de Bancada Refrigerada (Hettich Modelo 320R, Tuttlingen, Alemanha)
  • SpeedVac (Christ modelo RVC 2-25, Osterode am Harz, Alemanha) no LabMeta - Instituto de Química - UFRJ
  • Liofilizador (modelo L120, Liotop, Brazil)


Preparo das Soluções Estoque:
Solução Estoque de NaNO3 :
  • Utilize um frasco devidamente lavado (lavado previamente com extran 5% e rinsado com água destilada até exaustão)
  • Acrescente 7,5 g de NaNO3 (NEON, p# 01813) a 100 mL de água destilada
  • Armazene a solução sob resfriamento em geladeira

Uso: 1 mL para cada 1 litro de meio.
Solução Estoque de NaH2PO4•H2O :
  • Utilize um frasco previamente lavado (lavado previamente com extran 5% e rinsado com água destilada até exaustão)
  • Adicione 0,5 g de NaH2PO4•H2O (NEON, p# 01415) a 100 mL de água destilada
  • Armazene a solução sob resfriamento em geladeira

Uso: 1 mL para cada 1 litro de meio.
Solução Estoque de Metais-Traço:
  • Utilize um frasco lavado (lavado previamente com extran 5% e rinsado com água destilada até exaustão).
  • Adicione os seguintes componentes:
  • 23 mg de ZnSO4•7H2O
  • 152 mg de MnSO4•H2O
  • 7,3 mg de Na2MoO4•2H2O
  • 14 mg de CoSO4•7H2O
  • 6,8 mg de CuCl2•2H2O
  • 4,6 g de Fe(NH4)2(SO4)2•6H2O
  • 4,4 g de Na2EDTA•2H2O
Complete o volume com água destilada até 1 litro.
  • Armazene a solução sob resfriamento em geladeira
Uso: 1 mL para cada 1 litro de meio.
Solução Estoque de Vitaminas:
  • Utilize um frasco que tenha sido previamente lavado (lavado previamente com extran 5% e rinsado com água destilada até exaustão).
  • Adicione os seguintes componentes:
  • 200 mg de Tiamina
  • 10 mL (0,1 g) de Biotina
  • 1 ml (1 g/l) de Cianocobalamina
Complete o volume com água destilada até 1 litro.
  • Armazene a solução sob resfriamento em geladeira
Uso: Após a autoclavagem do meio, adicione 1 mL para cada 1 litro de meio.
Preparo de Solução Estoque de Nutrientes:
  • Misture:
  • 20 ml da Solução Estoque de NaNO3
  • 20 ml da Solução Estoque de NaH2PO4.H2O
  • 1 ml da Solução Estoque de Vitaminas
  • 1 ml da Solução Estoque de Metais-Traço
  • Filtração em filtro em 0.22 um
  • Armazene a solução sob resfriamento
Preparo dos Tampões de Algodão:
Materiais necessários: algodão hidrofóbico, gaze, tesoura, barbante.
  • Corte um pedaço de gaze do tamanho da palma da mão.
  • Abra a gaze e insira parte dela dentro do frasco.
  • Coloque o algodão hidrofóbico dentro da gaze que está dentro da boca do frasco.
  • Continue inserindo algodão até que, ao retirar a gaze com o algodão do frasco, um som semelhante a "puf" seja ouvido (indicando o vácuo causado pelo Tampão).
  • Corte um pedaço de barbante.
  • Amarre a gaze com o barbante, assegurando que fique bem acima do algodão (sem deixar espaço).
  • Corte o excesso de barbante e gaze.
  • Verifique se o Tampão está um pouco acima da boca do vidro.
  • Se necessário, ajuste sua posição.
  • Autoclave: 15 minutos a 15 min a 121oC.
  • Seque o frasco tampado com os Tampões de algodão na estufa por 8-12 horas a 70°C.

Garanta que cada etapa seja seguida de maneira precisa para assegurar a qualidade do meio de cultivo e dos procedimentos subsequentes.
Os Tampões de algodão são reutilizadas de um cultivo para o próximo. Ao final do cultivo, é suficiente secá-las em uma estufa para evitar a proliferação de fungos.
Preparo do Meio de Cultivo F/2:
  • Para 1 litro de água destilada, adicione:
  • 41,5 gramas de sal marinho para aquario (Reef Salt)
  • 1 mL de Solução Estoque de NaNO3
  • 1 mL de Solução Estoque de NaH2PO4•H2O
  • 1 mL de Solução Estoque de Metais-Traço
  • Autoclave: 15 minutos a 15 min a 121oC
  • Aguarde o resfriamento.

  • Adicione 0,5 mL da Solução Estoque de vitaminas antes de usar.
Preparo Anterior ao Cultivo
Preparo Anterior ao Cultivo
Separe todos os frascos Erlenmeyer de 500 mL
  • Lave-os com Extran a 5%.
  • Enxágue-os abundantemente com água destilada.

Importante considerar o número de cepas e réplicas a serem cultivadas.
Prepare os Tampões de algodão para vedar os cultivos
Autoclave os frascos previamente lavados com os Tampões de algodão
  • Autoclave: 15 minutos a 15 min a 121oC.
  • Seque o frasco tampado com os Tampões de algodão na estufa por 8-12 horas a 70°C.
Autoclave os frascos contendo o meio de cultivo F/2
  • Para 22 frascos: 22 x 200 ml = 4.4 litros (arredondado para 5 litros).
  • Prepare a solução em um frasco de 5 litros e divida em frascos Schott de 1 litro.
  • Autoclave: 15 minutos a 15 min a 121oC.
Após o meio de cultivo resfriar, adicione 0,5 mL de solução de vitaminas (previamente filtrada em filtro de seringa: 0.22 um )
  • Nota: Não utilize o filtro de seringa de 0.45 um
  • Identifique cada frasco Erlenmeyer com etiquetas contendo código (rastreável na lista de amostras do projeto) e data de produção
  • As datas de produção de cada espécime, adição de solução de nutrientes e coletas de biomassa devem ser documentadas na lista de amostras do projeto.
  • Garanta que cada etapa seja realizada de forma meticulosa para assegurar um início apropriado para o cultivo e um rastreamento confiável dos processos subsequentes.
Inoculação
Inoculação
Utilizando alças estéreis, proceder à coleta da biomassa de um cultivo previamente preparado
  • Quantidade: "tufo" com dimensões semelhantes a uma moeda de 50 centavos.
  • É imperativo realizar todas as operações utilizando luvas descartáveis e minimizar a exposição ao fluxo de ar.
  • Vede adequadamente os frascos Erlenmeyer com os Tampões de algodão preparados anteriormente.
Manutenção do Cultivo
Manutenção do Cultivo
Para manter as cianobactérias em fase logarítmica, é essencial fornecer alimentação frequente por meio da adição da Solução Estoque de Nutrientes, preparada previamente
  • Em cada cultivo, é recomendado adicionar 200 μL da Solução Estoque de Nutrientes.

A necessidade de nutrientes nas cianobactérias pode ser visualizada pela sua coloração verde característica.
Coleta da biomassa e tratamento
Coleta da biomassa e tratamento
O período de cultivo está estipulado em:
  • 28 dias.
  • Com a adição da Solução Estoque de Nutrientes a cada intervalo de 7 dias.
Ao término dos 28 dias, de cada frasco Erlenmeyer, será coletada uma quantidade que corresponda visualmente a 80-90% da biomassa
  • Permitiremos que cada espécime continue seu crescimento até que seja necessário interrompê-lo.
  • Inicialmente, podemos fixar um limite de 4 meses para cada espécime.
Transfira o meio de cultivo de cada frasco Erlenmeyer com a biomassa para um tubo cônico de centrífuga de 50 mL (tipo Falcon), devidamente identificado com etiqueta (correspondente ao código de referência na lista de amostras)
  • Centrifugue: 3011 xg (4500 rpm) por 15 minutos a 4°C
  • Descarte o sobrenadante
  • Continue transferindo o conteúdo de cada frasco Erlenmeyer, centrifugando e descartando o sobrenadante até completa eliminação de todo o conteúdo aquoso
  • Registre o volume de biomassa obtido (foto para arquivo)
Submeta cada amostra devidamente identificada a processo de liofilização à secura
  • Cada amostra deve ser identificada separadamente em tubos Falcon limpos e semi-rosqueados (para nao haver contaminação cruzada das amostras)
  • Inserir detalhes e observações pertinentes no Metadata.
  • Sempre armazene em freezer a -20 oC