Covid sekventering - SSI

Theis Hass THTR Thorsen; Sekventeringsenheden SB

Sep 11, 2024

Covid sekventering - SSI

Forked from a private protocol

DOI

dx.doi.org/10.17504/protocols.io.j8nlkwqw6l5r/v1

Theis Hass THTR Thorsen^1,2,
Sekventeringsenheden SB^1,2

¹Department of Sequencing and Bioinformatics;
²Statens Serum Institut

Sekventeringsenheden SB

Sequencing and Bioinformatics

DOI: dx.doi.org/10.17504/protocols.io.j8nlkwqw6l5r/v1

Protocol Citation: Theis Hass THTR Thorsen, Sekventeringsenheden SB 2024. Covid sekventering - SSI. protocols.io https://dx.doi.org/10.17504/protocols.io.j8nlkwqw6l5r/v1

License: This is an open access protocol distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited

Protocol status: Working

We used this protocol before automating the workflow.

Created: April 19, 2023

Last Modified: September 11, 2024

Protocol Integer ID: 80773

Keywords: Covid, SARS-CoV-2, Virus, Statens Serum Institut, SSI, Sequencing, Illumina, Whole genome sequencing, WGS, Detection, NextSeq, NextSeq 550, High-throughput sequencing, High-throughput, Next-generation sequencing, NGS

Funders Acknowledgement:

European Health and Digital Executive Agency (HaDEA)

Grant ID: 101111879

Disclaimer

This method was not developed from scratch at Statens Serum Institut. It is a method composed of methods from Beckman Coulter (RNA cleanup), NEB (RT-qPCR) and Illumina (Library preparation and sequencing). See under Protocol References for links to the original protocols.

Abstract

Method used at Statens Serum Institut for detection and sequencing of SARS-CoV-2 from saliva tests. 
This protocol is specified for high-throughput sequencing of 384 samples - 376 positive SARS-CoV-2 samples + 8 control samples divided into four 96-well PCR plates. Furthermore, the samples are sequenced on the Illumina sequencing platform using a NextSeq 550.
Note, this protocol is in Danish.

Image Attribution

Statens Serum Institut, www.ssi.dk. 

Guidelines

Arbejdsmængden i denne protokol kan med fordel deles over to dage.
Dag 1
RNA oprensning 
RT-qPCR 
Præ-PCR delen af biblioteksklargøringen 
Dag 2 
Post-PCR delen af biblioteksklargøringen
Sekventering 

Materials

Instrumenter:
- Køl/Frys
- Centrifuge (prøverør fra patienter)
- Centrifuge (96-brønds plader)
- Centrifuge (1,5 mL rør / 15 mL rør / 50 mL rør)
- LAF bænk (1-3 stk.)
- Vortex
- Vortex ("multi-tube")
- Stinkskab
- RT-qPCR instrument (1-4 stk.)
- PCR instrument (1-4 stk.)
- Qubit 4 Fluorometer
- NextSeq 550

Redskaber:
- Pipetter - P10, P20, P200, P1000 
- Multikanals - 0,2-10 uL, 10-300 uL, 50-1200 uL
- Magneter (96-brønds plader)
- Magneter (1,5 mL rør)
- Stopur
- Rent-rum (1-3 stk.)
- Køleblok (1,5 mL rør)

Forbrugsvarer:
- 96-brønds "Deep well"-plader
- 96-brønds PCR-plader
- 8-rør PCR-strimmel
- Qubit rør
- "Seals"
- Handsker (gerne med høj gennembrudstid)
- Sikkerhedsbriller
- Is

Protocol materials

ReagentPK BufferBeckman CoulterCatalog #C42150Step 7.1
 
ReagentLysis LBFBeckman CoulterCatalog #C42153Step 10
 
ReagentFSM HTIllumina, Inc.Catalog #20044407Step 39
 
ReagentBuffer CartridgeIllumina, Inc.Catalog #20024904In 3 steps
 
ReagentQubit™ 1X dsDNA HS Assay KitInvitrogen - Thermo FisherCatalog #Q33231Step 107
 
ReagentITBIllumina, Inc.Catalog #20044405In 4 steps
 
ReagentProteinase KBeckman CoulterCatalog #C42176In 2 steps
 
ReagentIPM HTIllumina, Inc.Catalog #20044407In 2 steps
 
ReagentEPM HTIllumina, Inc.Catalog #20044407In 2 steps
 
ReagentCPC HTIllumina, Inc.Catalog #20043401Step 4
 
ReagentTarget-specific Reverse primerStep 25
 
ReagentBind BBDBeckman CoulterCatalog #C42156In 3 steps
 
ReagentEtOHIn 2 steps
 
ReagentCPP1 HTIllumina, Inc.Catalog #20044407Step 39
 
ReagentHT1 hybridization bufferIllumina, Inc.Catalog #20015892In 3 steps
 
Reagent200mM Tris-HCl pH 7TeknovaCatalog #T2260In 2 steps
 
ReagentNuclease-free WaterIn 3 steps
 
ReagentWash WBEBeckman CoulterCatalog #C42172In 2 steps
 
ReagentCPP2 HTIllumina, Inc.Catalog #20044407Step 39
 
ReagentMid Output Reagent Cartridge v2.5 (150 cycles)Illumina, Inc.Catalog #20024904In 5 steps
 
ReagentTB1 HTIllumina, Inc.Catalog #20044407Step 61
 
Reagent1 M NaOHIn 2 steps
 
ReagentFluorescently-labeled probeStep 25
 
ReagentNuclease-free WaterNEBCatalog ##E3007EStep 25
 
ReagentTarget-specific Forward primerStep 25
 
Reagent100% Isopropanol In 2 steps
 
ReagentMid Output Flow Cell v2.5Illumina, Inc.Catalog #20024904In 2 steps
 
ReagentIDT for Illumina- PCR Indexes Sets 1-4Illumina, Inc.Catalog #20043137In 2 steps
 
ReagentRSB HTIllumina, Inc.Catalog #20044409Step 109
 
Reagent1 x PBS bufferStep 5
 
ReagentST2 HTIllumina, Inc.Catalog #20044405In 2 steps
 
ReagentHT1Illumina, Inc.Catalog #20015892Step 61
 
ReagentLuna Probe One-Step Reaction Mix (No ROX) (2X)NEBCatalog ##E3007EStep 25
 
ReagentRVT HTIllumina, Inc.Catalog # 20044407Step 46
 
ReagentLuna WarmStart® RT Enzyme Mix (20X)NEBCatalog ##E3007EStep 25
 
ReagentEPH3 HTIllumina, Inc.Catalog #20044407In 2 steps
 
ReagentTWB HTIllumina, Inc.Catalog # 20044406In 2 steps
 
ReagentEBLTS HTIllumina, Inc.Catalog # 20044406In 2 steps
 
ReagentRSB HTIllumina, Inc.Catalog # 20044406In 4 steps

Safety warnings

Denne protokol involverer arbejde med levende SARS-CoV-2 virus celler. Brug derfor gerne mundbind eller lignende beskyttelse.

Arbejd forsigtigt med korrekt beskyttelse (kittel, handsker og beskyttelsesbriller, stinkskab) når der arbejdes med følgende reagenser:

Proteinase K   
Sundhedsfare
Kronisk sundhedsfare
SDS: RNAdvance Viral.pdf288KB  
Wash WBE
Sundhedsfare
Ætsende
SDS: RNAdvance Viral.pdf288KB  
Lysis LBF:
Sundhedsfare
Kronisk sundhedsfare
Ætsende
SDS: RNAdvance Viral.pdf288KB  
ST2 HT
Sundhedsfare
SDS: 20043141_SDS_ST2_HT_COVIDseq (2).pdf167KB  
TB1 HT
Kronisk sundhedsfare
Sundhedsfare
SDS: 20043141_SDS_TB1_HT_COVIDseq (1).pdf215KB  
EPM HT
Kronisk sundhedsfare
Akut giftig
Miljøfare
Sundhedsfare
SDS: 20043141_SDS_EPM_HT_COVIDseq (3).pdf172KB  

Ethics statement

This protocol involves the use of human samples, and prior approval from the users' Institutional Review Board (IRB) or equivalent ethics committee(s) is required before usage. All procedures must comply with ethical guidelines and data protection regulations to ensure the privacy of personal information.

Before start

Husk at der til at start med arbejdes med levende vira. Brug derfor passende beskyttelse som kittel, handsker og mundbind.

Modtagelse af prøver

Modtag og registrér prøverne.

Opbevar prøverne på køl/frys (alt efter hvor lang tid der går, før prøverne skal bruges), eller fortsæt med det samme. 

RNA-oprensning

Safety information
Der arbejdes med levende virus. Arbejd derfor forsigtigt med prøverne med korrekt personbeskyttelse (kittel, briller, handsker og mundbind).

Note
Arbejd med prøverne i et "rent-rum" for at undgå kontaminering af amplicons.

Centrifugér prøverørene for at samle prøvematerialet/-mediet (podepinde) i bunden af røret. 

"Decap" prøverne i en LAF-bænk. 
"Decap" derefter en negativ og positiv (ReagentCPC HTIllumina, Inc.Catalog #20043401 Concentration5 Kopier pr. uL  ) kontrol.

Note
Hold kontrollerne adskilt fra prøverne for at undgå krydskontaminering af/fra kontrollerne.

Tilsæt Amount700 µL   Reagent1 x PBS buffer  til alle prøverne og kontrollerne.

Ryst prøverne ved Shaker750 rpm, Room temperature , 00:10:00 .

Imens klargøres følgende tre reagenser:

Klargøring af Proteinase K.
Safety information
Proteinase K 
Sundhedsfare
Kronisk sundhedsfare
Arbejd med korrekt personbeskyttelse (kittel, briller og handsker).


Tilsæt Amount10 mL   ReagentPK BufferBeckman CoulterCatalog #C42150  til røret/flasken med ReagentProteinase KBeckman CoulterCatalog #C42176  (Den endelige koncentration er 50 mg/mL).

For at undgå skum, mix ved at vende røret/flasken nogle gange og lad det stå i 5 minutters tid, inden det bruges. Opbevar Proteinase K opløsningen på -20 °C når det ikke bruges.

(Spring dette trin over hvis reagenset allerede er klar).

Klargøring af vaske buffer.
Safety information
Wash WBE
Sundhedsfare
Ætsende
Arbejd med korrekt personbeskyttelse (kittel, briller og handsker).

Tilsæt Amount225 mL   Reagent100% Isopropanol   til flasken med ReagentWash WBEBeckman CoulterCatalog #C42172 .

Notér på flasken hvornår der er blevet tilsat Isopropanol, og opbevar "Wash WBE" ved stuetemperatur.

(Spring dette trin over hvis reagenset allerede er klar).

Klargøring af "beads".
Note
"Beads" er nødt til at blive gjort klar på dagen, hvor de skal bruges. 
Et eventuelt overskud kan ikke gemmes til dagen efter.

Vortex røret med ReagentBind BBDBeckman CoulterCatalog #C42156  i mindst 30 sek. for at få resuspenderet "beads" ordentligt.

Per prøve: 
Mix Amount5 µL   ReagentBind BBDBeckman CoulterCatalog #C42156  med Amount200 µL   Reagent100% Isopropanol  .
Mix grundigt.

Når prøverne er blevet vortexet, overfør da Amount200 µL   fra hver prøve/kontrol til en "deep well" plade (94 prøver + 2 kontroller pr. plade). 
Registrér i hvilken brønd hver prøve/kontrol bliver overført til.

Tilsæt Amount10 µL   ReagentProteinase KBeckman CoulterCatalog #C42176  (50 mg/mL) til hver brønd med en prøve/kontrol.

Safety information
Lysis LBF
Sundhedsfare
Kronisk sundhedsfare
Ætsende
Arbejd med korrekt personbeskyttelse (kittel, briller og handsker).


Tilsæt Amount150 µL   ReagentLysis LBFBeckman CoulterCatalog #C42153  til hver brønd.
Mix grundigt ved at pipettere op og ned 10 gange.

"Seal" pladen og lad den inkubere i Duration00:20:00 Room temperature .

Note
Herefter er virus ikke længere aktivt (og kan dermed ikke smitte).

20m

Tilsæt Amount205 µL   ReagentBind BBDBeckman CoulterCatalog #C42156  (med isopropanol) til hver brønd, og mix 10 gange ved pipettering eller indtil de er mixet grundigt nok. 
Husk at mix "beads" inden de overføres til prøverne.

Inkubér prøverne i Duration00:05:00 Room temperature .

Placér prøvepladen på en magnet og vent i Duration00:05:00  .

Imens prøvepladen er på magneten. 
Fjern supernatanten og smid det ud.

Fjern prøvepladen fra magneten. 
Tilsæt Amount400 µL   ReagentWash WBEBeckman CoulterCatalog #C42172  (med isopropanol) til hver brønd for at vaske "beads". 
Mix 10 gange ved pipettering for at resuspendere de magnetiske "beads".

Placér prøvepladen på en magnet og vent i Duration00:05:00  .
Prøverne (væsken) skal være 'klar', før der fortsættes.

Imens prøvepladen er på magneten. Undgå at forstyrre pellet med magnetiske "beads".
Fjern supernatanten og smid det ud.

Imens prøvepladen er på magneten. Prøverne skal ikke mixes.
Vask prøverne ved at tilsætte Amount400 µL   Concentration70 % (v/v)   ReagentEtOH , og lad prøverne stå i ~Duration00:02:00  .
Fjern ethanolen.

Gentag trin 18.

Lad de magnetiske "beads" tørre i Duration00:01:00 Room temperature  for at få de sidste dråber af ethanol til at fordampe. Undgå dog at "beads" tørrer helt ud.

Fjern prøvepladen fra magneten. 
Eluér RNA ved at tilføje Amount40 µL   ReagentNuclease-free Water  til hver brønd.
Mix 10 gange ved pipettering og inkubér prøverne i Duration00:05:00 Room temperature  (RNA'et er nu i væsken).

Stil prøvepladen tilbage på en magnet og vent i Duration00:02:00  .

Overfør eluatet med RNA fra hver brønd til de tilsvarende brønde i en ny 96-brønds PCR plade (uden at medtage "beads"). 
Stil straks prøverne med RNA på is (hvis de skal bruges med det samme) eller gem dem i længere tid på -20 til -80 °C.

Hvis denne RNA-oprensning kun har været af positive prøver, spring da til 'Covid sekventering - pre-PCR'.
Ellers fortsæt med 'RT-qPCR' nedenfor.

RT-qPCR

Start med at klargøre RT-qPCR "Master Mix" (MM) i et "rent-rum" væk fra prøverne for at undgå kontaminering.

Følgende komponenter skal bruges:
ReagentLuna Probe One-Step Reaction Mix (No ROX) (2X)NEBCatalog ##E3007E  
ReagentLuna WarmStart® RT Enzyme Mix (20X)NEBCatalog ##E3007E  
ReagentNuclease-free WaterNEBCatalog ##E3007E  
ReagentTarget-specific Forward primer  
ReagentTarget-specific Reverse primer  
ReagentFluorescently-labeled probe  
Note
Primer og probe benyttet af Testcenter DK. Bestilt hos LGC Biosearch.

"Forward primer" - E_Sarbeco_F
ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT

"Reverse primer" - E_Sarbeco_R
ATATTGCAGCAGTACGCACACA

Fluorescerende probe - E_Sarbeco_P1
FAM-ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG-BHQ1

Tø alle komponenterne ved stuetemperatur og stil dem på is.
Når alle komponenterne er tøet op, mix kortvarigt hver komponent ved at vende røret, pipettering eller forsigtig vortexing.

Benyt nedenstående tabel og gang voluminerne med antallet af prøver der skal analyseres (+1-2 prøver for at have nok MM).
KomponenteruL pr. prøve
Luna Probe One-Step React Mix (NoRox) (2X)12,5
Dnase/ Rnase frit vand3,75
Luna WarmStart RT Enzyme Mix (20X)1,25
Forward primer (10 uM)1
Reverse primer (10 uM)1
Probe (10 uM)0,5
Total20
Komponenter og voluminer (pr. prøve) til RT-qPCR MM.

Mix MM grundigt men forsigtigt ved pipettering eller vortexing efterfulgt af en kort centrifugering.

Pipettér Amount20 µL   MM til hver brønd (svarende til antal prøver + kontroller) i en ny 96-brønds PCR plade. Undgå bobler.

Overfør Amount5 µL   RNA prøve materiale fra alle brønde i eluat-pladen til den nye plade med MM. 
Gør det forsigtigt for at undgå kontaminering mellem prøverne.

Luk pladen med optisk transparent "seal". 
Det er vigtigt at prøverne er helt lukket til for at undgå fordampning under RT-qPCR.

Spin pladen ved Centrifigation2500-3000 rpm, Room temperature, 00:01:00  for at fjerne bobler og samle dråber.

Programmér "real-time" PCR instrumentet.

Note
RT-qPCR programmet der blev brugt hos Testcenter DK til bestemmelse af Covid-19.
TrinTemp.TidRunder
"Reverse Transcription"55ºC10:001
"Initial Denaturation"95ºC03:001
"Denaturation"95ºC00:1545
"Extension" 58ºC00:30
RT-qPCR program
Husk:
At "plate read" skal være inkluderet i slutningen af hver "extension" trin.
At passende detektionskanal(er) for den eller de valgte fluoroforer er til stede.

Noter:
Hos Testcenter DK blev følgende to "real-time" PCR instrumenter benyttet: 
Biorad CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System 
Biorad CFX OPUS Real-Time PCR system

Sæt prøvepladen i "real-time" PCR instrumentet og igangsæt kørslen.

Analyse af RT-qPCR resultater

Åben datafilen i det valgte data analyse program. 

Note
Hos Testcenter DK blev softwaren 'CFX Maestro' fra Biorad benyttet.

Sæt 'baseline'.
(i CFX Maestro) Vælg “Apply Fluorescense Drift Correction” fra menuen “Settings” → “Baseline Settings”.

Sortér Ct-værdier (høj til lav).
Dobbelt-klik på trekanten i kolonnen (Cq) med Ct-værdier.

Hvis der er signal-støj i de første 10 cykler, som forstyrrer analysen af PCR-kurverne, skær da de første 10 cykler væk. 
Tryk på ”Settings”→”Cycle to analyze” og ændre fra 1 til 10.

Vurdér om den positive kontrol har en sigmoid (S-formet) PCR-kurve.
Hvis der ikke er tale om en S-kurve, skal prøverne køres om.

Vurdér om prøverne er positive, inkonklusive eller negative baseret på de tre parametre:
"End relative fluorescence units" (End RFU)
Ct-værdi
Er PCR-kurven sigmoid eller ej (subjektiv bedømmelse)

Positiv prøve
ScenarieParameterVærdi
1End RFU> 500
Ct-værdi10 - 38
PCR-kurvesigmoid

Inkonklusiv prøve
ScenarieParameterVærdi
1End RFU> 500
Ct-værdi38 - 40
2End RFU> 500
Ct-værdi10 - 38
PCR-kurveikke sigmoid

Negativ prøve
ScenarieParameterVærdi
1End RFU< 500
2Ct-værdi< 10
3Ct-værdi> 40

Go togo to step #7 (RNA-oprensning)  og lav en frisk RNA-oprensning af de positive prøver.

Covid sekventering - pre-PCR

Note
Følgende arbejde skal udføres i et "rent-rum" og/eller (ren) LAF-bænk for at undgå kontaminering af amplicons og det forgående arbejde.

De følgende to MM kan med fordel klargøres i samme rum som den tidligere MM (til RT-qPCR) for at være sikker på at undgå kontaminering.

Start med at finde følgende reagenser frem fra -20°C-fryseren:

ReagentEPH3 HTIllumina, Inc.Catalog #20044407  
ReagentFSM HTIllumina, Inc.Catalog #20044407  
ReagentCPP1 HTIllumina, Inc.Catalog #20044407  
ReagentCPP2 HTIllumina, Inc.Catalog #20044407 
ReagentIPM HTIllumina, Inc.Catalog #20044407  

Lad dem tø ved stuetemperatur, og hold dem derefter på is indtil de skal bruges.

"Anneal RNA"

Navngiv en 96-brønds PCR plade med 'CDNA' + et unikt ID.

Vend røret med ReagentEPH3 HTIllumina, Inc.Catalog #20044407  nogle gange og tilsæt Amount9 µL   til det nødvendige antal brønde i CDNA-pladen.

Overfør herefter Amount9 µL   fra hver brønd i eluat-pladen (positive prøver + kontroller) til CDNA-pladen.

"Seal" og ryst prøverne ved Shaker1600 rpm, Room temperature , 00:01:00 .

Centrifugér prøverne ved Centrifigation1000 rpm, Room temperature , Kortvarigt .

Kør PCR på prøverne med "Anneal"-programmet.

Note
"Anneal"-program
Temp.TidRunder
65°C03:001
4°C∞1
"Anneal"-program 
Husk:
"Preheat lid" skal vælges til.
Reaktions volumen er 18 μL.

Syntetisering af "first strand cDNA"

Hent ReagentRVT HTIllumina, Inc.Catalog # 20044407  fra -20°C-fryseren og stil det direkte på is (skal hele tiden holdes kold).

Klargør "first strand cDNA" MM.
Benyt nedenstående tabel og gang voluminerne med antallet af prøver (+1-2 prøver for at have nok MM. Hvis der er mange prøver så tilsæt lidt ekstra). 
Vend begge komponenter nogle gange før de bruges.
KomponenteruL pr. prøve
FSM HT9
RVT HT1
Total10
Komponenter og voluminer (pr. prøve) til "first strand cDNA" MM.

Vend forsigtigt den endelige MM nogle gange.

Tilsæt Amount8.5 µL   MM til hver brønd med prøver og kontroller.
Gør det forsigtigt og husk at skifte spids mellem hver brønd for at undgå  kontaminering mellem prøverne.

"Seal" og ryst prøverne ved Shaker1600 rpm, Room temperature , 00:01:00 .

Centrifugér prøverne ved Centrifigation1000 rpm, Room temperature , Kortvarigt .

Kør PCR på prøverne med "FSS"-programmet.

Note
"FSS"-program
Temp.TidRunder
25°C05:001
50°C10:001
80°C05:001
4°C∞1
"FSS"-program
Husk:
"Preheat lid" skal vælges til.
Reaktions volumen er 26,5 μL.

Amplificering af cDNA

For hver CDNA-plade, navngiv to nye med hhv. "COVA" og "COVB" + et unik ID så det er tydeligt, at de hører sammen.
COVA- og COVB-pladerne er to separate PCR reaktioner til hver prøve + kontrol i den tilhørende CDNA-plade.

Klargør "COVIDseq PCR A" MM og "COVIDseq PCR B" MM.
Benyt nedenstående tabel og gang voluminerne med antallet af prøver (+1-2 prøver for at have nok MM. Hvis der er mange prøver så tilsæt nogle ekstra). 
Vend ReagentIPM HTIllumina, Inc.Catalog #20044407  nogle gange før det bruges.

KomponenterCOVIDseq PCR A - uL pr. prøveCOVIDseq PCR B - uL pr. prøve
IPM HT1515
CPP1 HT4,3-
CPP2 HT-4,3
Nuclease-frit vand4,74,7
Total2424
Komponenter og voluminer (pr. prøve) til "COVIDseq PCR" MM A og B.

Vend forsigtigt de endelige MM nogle gange for at blande dem.

Tilsæt Amount20 µL   "COVIDSeq PCR A" MM til hver nødvendig brønd i COVA-pladen. 

Tilsæt Amount20 µL   "COVIDSeq PCR B" MM til hver nødvendig brønd i COVB-pladen.

Overfør Amount5 µL   fra hver brønd i CDNA-pladen til de tilsvarende COVA- og COVB-plader. 
Gør det forsigtigt og husk at skifte spids mellem hver brønd for at undgå  kontaminering mellem prøverne.

"Seal" og ryst prøverne ved Shaker1600 rpm, Room temperature , 00:01:00 .

Centrifugér prøverne ved Centrifigation1000 rpm, Room temperature , Kortvarigt .

Kør PCR på prøverne med "COVIDSeq PCR"-programmet.

Note
"COVIDSeq PCR"-program
Temp.TidRunder
98°C03:001
95°C00:1535
63°C05:00
4°C∞1
"COVIDSeq PCR"-program
Husk:
"Preheat lid" skal vælges til.
Reaktions volumen er 25 μL.

Prøverne kan blive i PCR-instrumentet natten over.

Covid sekventering - post-PCR

Note
For at undgå krydskontamineringer med amplicons skal det efterfølgende arbejde foregå i et andet rum dedikeret til at arbejde med amplicons.

Find følgende reagenser frem.

Reagenser opbevaret ved stuetemperatur:
ReagentST2 HTIllumina, Inc.Catalog #20044405  
ReagentITBIllumina, Inc.Catalog #20044405  

Reagenser opbevaret på køl:
ReagentEBLTS HTIllumina, Inc.Catalog # 20044406  
ReagentNuclease-free Water  
ReagentTWB HTIllumina, Inc.Catalog # 20044406  
ReagentRSB HTIllumina, Inc.Catalog # 20044406  - Hold røret på is indtil en halv time før det skal bruges.

Regenser opbevaret på frost:
ReagentTB1 HTIllumina, Inc.Catalog #20044407  - Hold røret på is.
ReagentEPM HTIllumina, Inc.Catalog #20044407  - Sæt på is når det er tøet op.
ReagentHT1Illumina, Inc.Catalog #20015892  - Sæt på is når det er tøet op.
ReagentIDT for Illumina- PCR Indexes Sets 1-4Illumina, Inc.Catalog #20043137 

Safety information
ST2 HT
Sundhedsfare
 Arbejd med korrekt personbeskyttelse (kittel, briller og handsker).

Safety information
TB1 HT
Kronisk sundhedsfare
Sundhedsfare
Arbejd med korrekt personbeskyttelse (kittel, briller og "tykke" handsker).

Safety information
EPM HT
Kronisk sundhedsfare
Akut giftig
Miljøfare
Sundhedsfare
Arbejd med korrekt personbeskyttelse (kittel, briller og "tykke" handsker).

Tagmentering af PCR Amplicons

11m

Start med at navngive en ny 96-brønds PCR plade med "TAG1" + et unik ID.

Kombinér COVA- og COVB-pladen på følgnde måde:

Overfør Amount10 µL   fra hver brønd i COVA-pladen til den tilhørende brønd i TAG1-pladen.

Overfør Amount10 µL   fra hver brønd i COVB-pladen til den tilhørende brønd i TAG1-pladen, der indeholder materiale fra COVA-pladen.

Klargør "Tagmentation" MM. 
Benyt nedenstående tabel og gang voluminerne med antallet af prøver (+1-2 prøver for at have nok MM). 
Vortex ReagentEBLTS HTIllumina, Inc.Catalog # 20044406  grundigt før brug. 
Safety information
Følgende arbejde skal foregå i et stinkskab, da TB1 HT indeholder N,N-Dimethylformamid. 
Arbejd med korrekt personbeskyttelse (kittel, briller og "tykke" handsker).
 
KomponenteruL pr. prøve
TB1 HT12
EBLTS HT4
Nuclease-frit vand20
Total36
Komponenter og voluminer (pr. prøve) til "Tagmentation" MM.

Vend forsigtigt den endelige MM nogle gange.

Tilsæt Amount30 µL   MM til alle brønde med prøver og kontroller i TAG1-pladen.
Gør det forsigtigt og husk at skifte spids mellem hver brønd for at undgå kontaminering mellem prøverne.

"Seal" og ryst prøverne ved Shaker1600 rpm, 00:01:00 minut .

Kør PCR på prøverne med "COVIDSeq TAG"-programmet (Tager ca. 7 min).

Note
"COVIDSeq TAG"-program
Temp.TidRunder
55°C05:001
10°C∞1
"COVIDSeq TAG"-program
Husk:
"Preheat lid" skal vælges til.
Reaktions volumen er 50 μL.

Post Tagmenterings "Clean Up"

Centrifugér TAG1-pladen ved Centrifigation1000 rpm, Room temperature , Kortvarigt . 

Safety information
Følgende arbejde skal foregå i et stinkskab, da TB1 HT (der er i brøndende på TAG1-pladen) indeholder N,N-Dimethylformamid. 
Arbejd med korrekt personbeskyttelse (kittel, briller og "tykke" handsker).

Tilsæt Amount10 µL   ReagentST2 HTIllumina, Inc.Catalog #20044405  til alle brønde med prøver og kontroller i TAG1-pladen.
Gør det forsigtigt og husk at skifte spids mellem hver brønd for at undgå kontaminering mellem prøverne samt skum og bobler i prøverne.

"Seal" og ryst prøverne ved Shaker1600 rpm, 00:01:00 minut .

Inkubér prøverne i Duration00:05:00 Room temperature  

Centrifugér TAG1-pladen ved Centrifigation1000 rpm, Room temperature , Kortvarigt . 
Inspicér for bobler på sealet. Hvis der er nogen, så gentag centrifugeringen. 

Fjern "seal" og sæt TAG1-pladen på en magnet. 
Vent til væsken er klar (~Duration00:03:00  ). 

Fjern og kassér supernatanten.
Gør det forsigtigt og husk at skifte spids mellem hver brønd for at undgå kontaminering mellem prøverne.
Undgå at forstyrre pellet.

Vask "beads" 2 gange på følgende måde:

Tag TAG1-pladen af magneten.

Tilsæt Amount100 µL   ReagentTWB HTIllumina, Inc.Catalog # 20044406  til alle brønde med prøver og kontroller.
Undgå at komme i kontakt med væsken i brøndene, og skift spidser efter hver plade.

"Seal" og ryst prøverne ved Shaker1600 rpm, 00:01:00 minut .

Centrifugér TAG1-pladen ved Centrifigation1000 rpm, Room temperature , Kortvarigt . 

Fjern "seal" og sæt TAG1-pladen på en magnet.
Vent til væsken er klar (~Duration00:03:00  ).

Første vask: 
Fjern og kassér supernatanten.
Gør det forsigtigt og husk at skifte spids mellem hver brønd for at undgå kontaminering mellem prøverne. Undgå at forstyrre pellet.

Anden vask: 
Gå videre til næste trin.

Amplificering af Tagmenterede Amplicons

Start med at tø en plade med  ReagentIDT for Illumina- PCR Indexes Sets 1-4Illumina, Inc.Catalog #20043137  op.
Vortex derefter pladen med index' ved Shaker1600 rpm, 00:01:00  og spin den ned ved Centrifigation1000 rpm, Room temperature, 00:01:00 .

Klargør PCR MM. 
Benyt nedenstående tabel og gang voluminerne med antallet af prøver (+1-2 prøver for at have nok MM). 
Vend ReagentEPM HTIllumina, Inc.Catalog #20044407  nogle gange før brug. 
Safety information
Følgende arbejde skal foregå i et stinkskab, da EPM HT indeholder Tetramethylammonium chloride. 
Arbejd med korrekt personbeskyttelse (kittel, briller og "tykke" handsker).
  
KomponenteruL pr. prøve
EPM HT24
Nuclease-frit vand24
Total48
Komponenter og voluminer (pr. prøve) til PCR MM.

Vend den endelige MM nogle gange.

Imens TAG1-pladen står på magneten. Gør det forsigtigt og husk at skifte spids mellem hver brønd for at undgå kontaminering mellem prøverne. Undgå at forstyrre pellet.
Fjern og kassér supernatanten.
Brug derefter en 20 uL pipette til at fjerne de sidste rester af vaske buffer.

Tag TAG1-pladen af magneten.

Tilsæt Amount40 µL   MM til alle brønde med prøver og kontroller i TAG1-pladen.
Gør det forsigtigt for at undgå  kontaminering mellem prøverne.

Åbn index-adaptor pladen ved at trykke en ny PCR-plade igennem foliesealet - kassér derefter PCR-pladen. Brug en ny PCR-plade til hver ny index-adapter plade. 
  

Overfør Amount10 µL   fra hver brønd i index-adaptor pladen til den tilhørende brønd i TAG1-pladen.
Gør det forsigtigt og husk at skifte spids mellem hver brønd for at undgå  kontaminering mellem prøverne.

"Seal" og ryst prøverne ved Shaker1600 rpm, 00:01:00 minut .

Hvis der er væske på sealet centrifugeres TAG1-pladen ved Centrifigation1000 rpm , Kortvarigt . 
For at resuspendere "beads", ryst pladen ved Shaker1600 rpm Kortvarigt .

Kør PCR på prøverne med "COVIDSeq TAG PCR"-programmet.

Note
"COVIDSeq TAG PCR"-program
Temp.TidRunder
72°C03:001
98°C03:001
98°C00:207
60°C00:30
72°C01:00
72°C03:001
10°C∞1
"COVIDSeq TAG PCR"-program
Husk:
"Preheat lid" på Temperature100 °C   skal vælges til.
Reaktions volumen er 50 μL.

"Pool" og oprensning af biblioteker

14m 40s

Stil ReagentRSB HTIllumina, Inc.Catalog # 20044406  ved stuetemperatur så det kan temperere (~Duration00:30:00  ).

30m

Centrifugér TAG1-pladen ved Centrifigation1000 rpm, Room temperature, 00:00:10 .

10s

Safety information
Husk at der stadig arbejdes med EPM.
Arbejd i et stinkskab og med korrekt personbeskyttelse (kittel, briller og "tykke" handsker).

Fjern "seal" og sæt TAG1-pladen på en magnet.
Vent til væsken er klar (~Duration00:03:00  ).

Samle ("Pool") prøverne og kontrollerne fra TAG1-pladen i et 1,5 mL rør på følgende måde:

Brug en 10 μl otte-kanals pipette til at overføre Amount5.5 µL   prøvemateriale fra hver brønd i TAG1-pladen til en 8 rør PCR-strimmel. Skift spidser efter hver kolonne.
Re-suspendér ved forsigtigt at pipettere op og ned nogle gange.

Dette resulterer i Amount66 µL   "poolet" bibliotek pr. række fra TAG1-pladen (hvis pladen er fyldt).

Navngiv et nyt 1,5 mL rør "Pooled ITB" + et unikt ID.

Overfør Amount55 µL   "poolet" bibliotek fra hver brønd i 8 rør PCR-strimlen til "Pooled ITB"-røret.

For hver prøveplade bliver resultatet et "Pooled ITB"-rør med Amount440 µL   "pooled" bibliotek (hvis prøvepladen er fyldt).

Vortex "Pooled ITB"-røret for at blande og centrifugér kortvarigt.

Vortex ReagentITBIllumina, Inc.Catalog #20044405  for at re-suspendere.

Tilsæt ReagentITBIllumina, Inc.Catalog #20044405  svarende til den resulterende volumen i "Pooled ITB"-røret ganget med 0,9.
For eksempel, for 96 prøver, tilsæt Amount396 µL   ReagentITBIllumina, Inc.Catalog #20044405  til "Pooled ITB"-røret.

Vortex for at blande.

Inkubér ved stuetemperatur i Duration00:05:00  

Centrifugér kort.

Sæt "Pooled ITB"-røret på en magnet og vent til væsken er klar (~Duration00:05:00  ).

Fjern og kassér supernatanten. 

Vask "beads" 2 gange på følgende måde:

Lad "Pooled ITB"-røret blive på magneten og tilsæt Amount1000 µL   frisk Concentration80 % (v/v)   ReagentEtOH  til røret.

Vent Duration00:00:30  .

30s

Fjern og kassér supernatanten.

Brug en 10 µL pipette til at fjerne rester af EtOH.

Note
Herefter behøver man ikke længere arbejde i et stinkskab.

Tilsæt Amount55 µL   ReagentRSB HTIllumina, Inc.Catalog # 20044406  

Vortex "Pooled ITB"-røret for at blande og centrifugér kort.

Inkubér ved stuetemperatur i Duration00:02:00  .

Sæt "Pooled ITB"-røret på magneten og vent til væsken er klar (~Duration00:02:00  ).

Overfør Amount50 µL   supernatant fra "Pooled ITB"-røret til et nyt rør mærket ”PP” (står for "Plate Pool") + et unikt ID.

Kvantificering og Normalisering

Fortynd biblioteket fra PP-røret 1:10 i et nyt rør ved at blande Amount4 µL   bibliotek i Amount36 µL   ReagentRSB HTIllumina, Inc.Catalog # 20044406 .

Vortex og spin ned.

Bestem koncentrationen af 1:10-fortyndingen på en
Equipment
Qubit 4
NAME
Fluorometer
TYPE
Invitrogen
BRAND
Q33238
SKU
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33238
LINK
med et ReagentQubit™ 1X dsDNA HS Assay KitInvitrogen - Thermo FisherCatalog #Q33231  (mål på 10µL).
Hvis biblioteket er uden for standardområdet, så mål i stedet på det ufortyndede bibliotek (PP-røret).

Note
Hvordan man måler på Qubit (Amount10 µL   prøve)
Tag et antal Qubit-rør (Invitrogen - Thermo Fisher #Q32856) frem matchende antallet af biblioteker + 2 mere til standarder.
Pipettér Amount190 µL   "working solution" i hvert rør.
Tilføj Amount10 µL   prøve eller standard.
Vortex alle rør og inkubér dem i Duration00:02:00   ved stuetemperatur. Tjek at der ikke er nogle bobler i væsken.
Fra forsiden på instrumentet vælg dsDNA og derefter 1x  dsDNA High Sensitivity.
Vælg Read Standards og følg anvisningerne. 
Efter begge standarder er målt, vælg Run samples og sørg for at "original sample volume" er sat til 10µL, samt at "output sample units" er sat til ng/µL. 
Sæt den første prøve i instrumentet og vælg Read tube. Notér koncentrationen. 
Forsæt med de resterende prøver.

Beregn molariteten (i nM) ved hjælp af følgende formel:
Brug 400 bp som den gennemsnitlige biblioteksstørrelse.

Beregning af biblioteks molariteten ud fra en koncentration (ng/uL)

Fortynd biblioteket i et nyt rør med en minimum volumen på Amount30 µL   og en koncentration på Concentration4 nanomolar (nM)  . Fortynd med ReagentRSB HTIllumina, Inc.Catalog #20044409 .
Vortex og spin ned.

Overfør Amount25 µL   fra 1-4 rør med 4 nM-fortyndinger til et nyt rør mærket “FP” (Står for "Final Pool") + et unikt ID.

Note
Det er muligt at samle flere biblioteker i den endelige FP. Hvor mange er styret af valget af sekventeringsinstrument samt valget af sekventeringskit. I denne protokol sekventeres der på en NextSeq 550 med et "Mid Output 150 cycle" kit, hvilket giver mulig for at kunne sekventere 376 SARS-CoV-2 prøver + 8 kontroller - det svarer til 4 prøveplader/biblioteker. 

Vortex FP-røret.

Sæt FP-røret på is indtil det skal bruges. 
Hvis det ikke skal bruges med det samme, så opbevar det på -20°C frys.

Sekventering

Find følgende reagenser frem

Opbevares ved stuetemperatur:
ReagentBuffer CartridgeIllumina, Inc.Catalog #20024904 
Reagent200mM Tris-HCl pH 7TeknovaCatalog #T2260  

Opbevares på køl:
ReagentMid Output Flow Cell v2.5Illumina, Inc.Catalog #20024904  
Reagent1 M NaOH  

Opbevares på frost:
ReagentMid Output Reagent Cartridge v2.5 (150 cycles)Illumina, Inc.Catalog #20024904  
- Kan sættes på køl dagen før for at tø.
ReagentHT1 hybridization bufferIllumina, Inc.Catalog #20015892  
- Stil på is når det er tøet op.

Denaturering og fortynding af biblioteker

Lav en frisk Concentration0.2 Molarity (M)   fortynding af NaOH. 
I et eppendorfrør blandes Amount400 µL   ReagentNuclease-free Water  med Amount100 µL   Reagent1 M NaOH . 
Vortex kort.

Overfør Amount5 µL   bibliotek fra FP-røret til et nyt 1,5 mL-rør.

Tilsæt Amount5 µL   0.2 M NaOH.

Vortex og centrifugér kortvarigt.

Inkubér ved stuetemperatur i Duration00:05:00  .

Tilsæt Amount5 µL   Reagent200mM Tris-HCl pH 7TeknovaCatalog #T2260  til røret.

Vortex og centrifugér kortvarigt.

Tilsæt Amount985 µL   afkølet ReagentHT1 hybridization bufferIllumina, Inc.Catalog #20015892  til røret (koncentrationen er nu Concentration20 picomolar (pM)  ).

Vortex og centrifugér kortvarigt.

Sæt røret på is.

Fortynd til Concentration1.3 picomolar (pM)   i et nyt 1,5 mL rør ved at blande Amount85 µL   Concentration20 picomolar (pM)   denatureret bibliotek med Amount1215 µL   afkølet ReagentHT1 hybridization bufferIllumina, Inc.Catalog #20015892 .

Vend røret et par gange og centrifugér kortvarigt.

Hold røret på is indtil sekventeringen skal klargøres.

NextSeq 550 kørsel

Vend ReagentMid Output Reagent Cartridge v2.5 (150 cycles)Illumina, Inc.Catalog #20024904  og ReagentBuffer CartridgeIllumina, Inc.Catalog #20024904  fem gange for at blande reagenserne. 

Overfør hele Concentration1.3 picomolar (pM)   biblioteket til ReagentMid Output Reagent Cartridge v2.5 (150 cycles)Illumina, Inc.Catalog #20024904  i den markerede position på kassetten. 

Tryk på Experiment på skærmen af 
Equipment
NextSeq 550
NAME
DNA Sequencer
TYPE
Illumina
BRAND
SY-415-1002
SKU
https://emea.illumina.com/systems/sequencing-platforms/nextseq/order-nextseq-550.html
LINK

Tryk på Sequence.

Vælg én af to "setup" muligheder:

Manual

Note
På forhånd udfyldes et "sample sheet" med alle de ønskede indstillinger og prøveinformationer. 

Eksempel på "sample sheet": Eksempel på Nextseq550 sample sheet.xlsx12KB . 
Noter:
- Grønne markeringer omkranset af '<...>' skal udfyldes/ændres med de ønskede informationer.
- Det endelige "Sample Sheet" skal gemmes som .csv-fil. Ellers accepterer instrumentet ikke filen.

Indtast et "Run Name" (og et "Library ID" hvis det ønskes).

Vælg paired end .

Indtast følgende informationer:
Index 1 og Index 2 sættes til 10,
Read 1 og Read 2 sættes til 74.

Vælg den ønskede "output folder".

"Browse" og vælg det klargjorte "sample sheet".

Vælg "Purge consumables for this run" til.

Tryk på Next.

Local Run Manager

Note
På forhånd klargøres kørslen ("Create run") i Local Run Manger (LRM) med de ønskede indstillinger og prøveinformationer. 
I denne protokol vælges der paired end,
og
Index 1 og Index 2 sættes til 10, 
Read 1 og Read 2 sættes til 74.

LRM åbnes enten fra skrivebordet på instrumentet, ved at åbne chromium eller ved at åbne og logge ind på LRM fra en arbejdscomputer, hvis computer og instrument er på samme netværk.
Se Local Run Manager Off-Instrument Software Guide (1000000011909) for hjælp til den sidste mulighed. 
https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/software_documentation/local-run-manager/local-run-manager-off-instrument-software-guide-1000000011909-00.pdf

Vælg det ønskede "run" fra listen med klargjorte kørsler.

Vælg den ønskede "output folder".

Tryk på Next.

Pak ReagentMid Output Flow Cell v2.5Illumina, Inc.Catalog #20024904  ud af indpakningen, og hold på siderne af flow cellen uden at røre ved glasset.

Placér flow cellen i instrumentet som ansvist på skærmen.

Tryk på Load.

Når lågen er lukket til, og sensorerne har registreret flow cellen, tryk på Next.

Åben lågen til højre på fronten af instrumentet.

Fjern affaldsbeholderen (den nederste beholder) med brugte reagenser, fragt affaldsbeholderen sikkert til et stinkskab (f.eks. i en lukket, tyk plastik pose) og kassér indholdet i overensstemmelse med gældende regionale, nationale og lokale love og regler.

Safety information
Affaldet indeholder N,N-Dimethylformamid. 
Kronisk sundhedsfare
Sundhedsfare
Arbejd med korrekt personbeskyttelse (kittel, briller og "tykke" handsker).

Skub affaldsbeholderen tilbage ind på sin plads i instrumentet. 
Når der høres/føles et klik, er den på plads.

Skub ReagentBuffer CartridgeIllumina, Inc.Catalog #20024904  ind på pladsen oven over affaldsbeholderen, som vist på skærmen. 
Når der høres/føles et klik, er den på plads.

Når sensorerne har registreret beholderen, luk lågen og tryk på Next.

Åben lågen til venstre på fronten af instrumentet.

Skub ReagentMid Output Reagent Cartridge v2.5 (150 cycles)Illumina, Inc.Catalog #20024904  ind i reagensrummet indtil kassetten ikke kan komme længere ind.

Luk lågen til reagensrummet og tryk på Load.

Når kassetten er kørt i position og sensorerne har registreret den, tryk på Next.

Tjek at "run parameters" er korrekte og tryk på Next.

Når instrumentet er færdig med at lave et automatisk tjek, tryk på Start.

Herefter begynder NextSeq'en at sekventere.

Hvor lang tid tager kørslen?

En kørsel med en ReagentMid Output Reagent Cartridge v2.5 (150 cycles)Illumina, Inc.Catalog #20024904   tager ~16 timer.

Protocol references

RNA-oprensningen er baseret på protokollen "RNAdvance Viral" af Beckman Coulter: 
https://www.beckman.com/search#q=c63510&t=coveo-tab-techdocs&f:@category=[Consumable%20IFU%2FSetting%20Sheet]&f:@documentlanguage=[English]

RT-qPCR er baseret på protokollen "Luna® Probe One-Step RT-qPCR Kit (No ROX)" af New England Biolabs: 
https://international.neb.com/-/media/nebus/files/manuals/manuale3007.pdf?rev=55ca1f890ce349b1a4f90a91f5dd2619&hash=9266AFA71FBCA0CAE10A6E213D40CDB1

Klargøring af bibliotek og opsætning af sekventering er baseret på følgende tre protokoller fra Illumina: 
Illumina COVIDSeq Test - Reference Guide - #1000000126053 v2
https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/Illumina-COVIDSeq-Test/illumina-covidseq-test-reference-guide-ruo-1000000126053-04.pdf
Denature and Dilute Libraries for the NextSeq 500 and NextSeq 550 Sequencing Systems - #15048776 v16
https://support-docs.illumina.com/IN/NextSeq550_DnD/Content/NextSeq550/DnD-NS550.htm?protocol=standard 
NextSeq 500 and NextSeq 550 Sequencing Systems - #15069765 v06
https://support-docs.illumina.com/IN/NextSeq_550-500/Content/IN/FrontPages/NextSeq-550-500.htm

	Komponenter	uL pr. prøve
	Luna Probe One-Step React Mix (NoRox) (2X)	12,5
	Dnase/ Rnase frit vand	3,75
	Luna WarmStart RT Enzyme Mix (20X)	1,25
	Forward primer (10 uM)	1
	Reverse primer (10 uM)	1
	Probe (10 uM)	0,5
	Total	20

Trin	Temp.	Tid	Runder
"Reverse Transcription"	55ºC	10:00	1
"Initial Denaturation"	95ºC	03:00	1
"Denaturation"	95ºC	00:15	45
"Extension"	58ºC	00:30	45

Scenarie	Parameter	Værdi
1	End RFU	> 500
	Ct-værdi	10 - 38
	PCR-kurve	sigmoid

Komponenter	COVIDseq PCR A - uL pr. prøve	COVIDseq PCR B - uL pr. prøve
IPM HT	15	15
CPP1 HT	4,3	-
CPP2 HT	-	4,3
Nuclease-frit vand	4,7	4,7
Total	24	24

	Komponenter	uL pr. prøve
	TB1 HT	12
	EBLTS HT	4
	Nuclease-frit vand	20
	Total	36

Temp.	Tid	Runder
72°C	03:00	1
98°C	03:00	1
98°C	00:20	7
60°C	00:30
72°C	01:00
72°C	03:00	1
10°C	∞	1

Temp.	Tid	Runder
25°C	05:00	1
50°C	10:00	1
80°C	05:00	1
4°C	∞	1

Public workspaceCovid sekventering - SSI

Covid sekventering - SSI