Aug 21, 2024

Public workspaceBakteriel WGS - SSI

DOI
dx.doi.org/10.17504/protocols.io.5qpvo3r7bv4o/v1
  • 1Department of Sequencing and Bioinformatics;
  • 2Statens Serum Institut
  • SSI - SB - Sequencing Core Facility
    Tech. support email: Sekventeringsenheden@ssi.dk
Sekventeringsenheden SB
Icon indicating open access to content
QR code linking to this content
DOI: dx.doi.org/10.17504/protocols.io.5qpvo3r7bv4o/v1
Protocol Citation: Theis Hass THTR Thorsen, Sekventeringsenheden SB 2024. Bakteriel WGS - SSI. protocols.io https://dx.doi.org/10.17504/protocols.io.5qpvo3r7bv4o/v1
License: This is an open access protocol distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License,  which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited
Protocol status: Working
We used this protocol before automating the workflow.
Created: August 08, 2023
Last Modified: August 21, 2024
Protocol Integer ID: 86116
Keywords: Sequencing, Bacterial sequencing, Bacterial WGS, WGS, NGS, Genome, Bacterial genome, SSI, Statens Serum Institut, MiSeq, Illumina, Bacteria
Funders Acknowledgement:
European Health and Digital Executive Agency (HaDEA)
Grant ID: 101111879
Disclaimer
This method is a scaled version of the original 'Illumina Nextera XT DNA Library Prep'.
See under References for a link to the original protocol.
Abstract
Method used at Sequencing Core Facility - Statens Serum Institut for sequencing of bacterial isolates.
This protocol is specified for high-throughput sequencing of 96 isolates (sometimes less depending on the number of isolates with large genomes). Furthermore, the genomes are sequenced on the Illumina sequencing platform using a MiSeq and the MiSeq 500-cycle v2 kit.
Note, this protocol is in Danish.
Note, it is also possible to use a 300-cycle Mid Output Kit v2.5 on a NextSeq for the sequencing, but this will not be covered in this protocol.
Image Attribution
Statens Serum Institut, www.ssi.dk.
Guidelines
For at begrænse krydskontaminering, skift spidser stort set efter hver brug.
Materials
Instrumenter:
- Køl/Frys
- Stinkskab
- Vortex
- Centrifuge (1,5 mL rør, PCR rør/plader)
- Qubit 4 Fluorometer (Invitrogen - Thermo Fisher Scientific (TFS))
- PCR-maskine
- Tapestation 4200 (Agilent Technologies)
- Miseq (Illumina)

Redskaber:
- Beskyttelsesbriller
- Pipetter - p10, p100, p200, p1000, p5000, p10000
- Multikanalpipette - 0,2-10 µL
- Magnetholder (96-brønds plader)

Forbrugsvarer:
- 1,5 mL "Lo-bind" rør
- 50 mL rør
- 96-brønds "Lo-bind" PCR-plader
- 8-rør "thin-walled" PCR-strimmel
- Qubit rør (#Q32856, Invitrogen - TFS)
- Pipettespidser (p10, p100, p200, p1000, p5000, p10000)
- "Seals"
- Propper til index rør (FC-131-2001 - FC-131-2004, Illumina)
- Fnugfri linse renseservietter
- Handsker (gerne med høj gennembrudstid)
- Is
Protocol materials
ReagentNuclease-free Water
Step 41
ReagentPhiX Control v3Illumina, Inc.Catalog #FC-110-3001
In 2 steps
ReagentD5000 ReagentsAgilent TechnologiesCatalog #5067-5589
Step 39.2
ReagentTagment DNA BufferIllumina, Inc.Catalog #FC-131-1096
In 2 steps
ReagentResuspension BufferIllumina, Inc.Catalog #FC-131-1096
In 3 steps
ReagentMilliQ water
Step 66
ReagentAMPure XP beadsBeckman CoulterCatalog #A63881
In 3 steps
Reagent1 M NaOH
Step 41
ReagentMiSeq 500 cycle Kit v2 - Reagent CartridgeIllumina, Inc.Catalog #MS-102-2003
In 6 steps
ReagentD5000 ScreenTapeAgilent TechnologiesCatalog #5067-5588
Step 39.2
Reagent1 M NaOH
Step 40
ReagentQubit™ 1X dsDNA HS Assay KitInvitrogen - Thermo FisherCatalog #Q33231
Step 37
ReagentAmplicon Tagment MixIllumina, Inc.Catalog #FC-131-1096
In 2 steps
ReagentEtOH
In 3 steps
ReagentHT1 - Hybridization BufferIllumina, Inc.Catalog #MS-102-2003
In 5 steps
Reagent10 mM Tris-Cl pH 8.5 with 0.1% Tween-20TeknovaCatalog #T7724
In 2 steps
ReagentPR2 - Incorporation BufferIllumina, Inc.Catalog #MS-102-2003
In 5 steps
ReagentMiSeq 500 cycle Kit v2 - Flow CellIllumina, Inc.Catalog #MS-102-2003
In 2 steps
ReagentIndex adaptersIllumina, Inc.Catalog #FC-131-2001 - FC-131-2004
Step 12
ReagentNeutralize Tagment BufferIllumina, Inc.Catalog #FC-131-1096
In 2 steps
ReagentNextera PCR Master MixIllumina, Inc.Catalog #FC-131-1096
In 2 steps
Safety warnings
Arbejd forsigtigt og med den/de korrekte beskyttelsesværn (laboratoriekittel, handsker og beskyttelsesbriller, stinkskab) når der arbejdes med følgende reagenser:

Tagment DNA Buffer
Kronisk sundhedsfare
Sundhedsfare
Tagment DNA Buffer SDS: https://illumina-sds.thewercs.com/External/MyDocuments/DownloadSingleFile?content=FBB45282-DBA4-4F0F-A31C-8C19AA529A01_FC-131-1096_PDF

N,N-Dimethylformamid
Kronisk sundhedsfare
Sundhedsfare
N,N-Dimethylformamid SDS: https://illumina-sds.thewercs.com/External/MyDocuments/DownloadSingleFile?content=C8A4CCCB-3E11-42B4-BF6E-7B6217FBEE2D_MS-102-2003_PDF
Before start
Fortynding af DNA-oprensninger
Inputkoncentrationen for de forskellige DNA-oprensninger kan være organismespecifik. Det vil sige at der kan være forskel på, hvor meget DNA der skal bruges til analysen ved sekventering af f.eks. en Salmonella vs Clostridium.
En ting der skal overvejes, inden der startes en WGS-kørsel, er hvor mange isolater det er muligt at samle i én kørsel, og dermed hvor mange Mbp der bruges til den endelige sekventering. I denne protokol benyttes en "500 cycles" kassette (MiSeq), der max. kan "loades" med 90 Mbp.
Til denne protokol fortyndes inputkoncentrationerne for DNA-oprensningerne normalt til 0,3 til 0,5 ng/µL. DNA-oprensningerne kan med fordel fortyndes i en 96-brønds PCR-plade, hvor koncentrationerne kan bestemmes med en Fluostar Omega Platereader.
Tagmentering af input-DNA
Tagmentering af input-DNA
1m
1m
Find følgende komponenter frem.

Komponenter opbevaret på frost:
ReagentAmplicon Tagment MixIllumina, Inc.Catalog #FC-131-1096
ReagentTagment DNA BufferIllumina, Inc.Catalog #FC-131-1096
- Tø op på is. Vend de optøede rør 3-5 gange og centrifugér derefter kortvarigt.

Safety information
Tagment DNA Buffer

Kronisk sundhedsfare
Sundhedsfare
Arbejd med korrekt personbeskyttelse (kittel, briller og handsker med høj gennembrudstid).


Komponent opbevaret ved stuetemperatur:
ReagentNeutralize Tagment BufferIllumina, Inc.Catalog #FC-131-1096
- Tjek for bundfald. Hvis der er bundfald til stede, vortex indtil alle partikler er resuspenderet.

Safety information
Følgende arbejde bør foregå i et stinkskab, da Tagment DNA Buffer indeholder N,N-Dimethylformamid.
Arbejd med korrekt personbeskyttelse (kittel, briller og handsker med høj gennembrudstid).

Navngiv en standard 96-brønds PCR-plade med "NTA" + et unik ID.
Tilføj Amount5 µL ReagentTagment DNA BufferIllumina, Inc.Catalog #FC-131-1096 til brøndene ved hjælp af en multikanalpipette.
Overfør prøverne - Amount2.5 µL DNA pr. prøve fra fortyndingspladen (justeret til Concentration0.3-0.5 ng/µL ).

Tilføj Amount2.5 µL ReagentAmplicon Tagment MixIllumina, Inc.Catalog #FC-131-1096 til hver brønd.

Brug en multikanalpipette indstillet på 10 µl til at blande hver prøve forsigtigt 5 gange.
"Seal" pladen og centrifugér den ved Centrifigation280 x g, 20°C, 00:01:00 .

1m
Placér pladen i en PCR-maskine og kør følgende opvarmningsprogram:

"Tagmentation" program
Temp.TidRunder
55°C05:001
10°C∞1
"Tagmentation" program

Så snart temperaturen når Temperature10 °C , centrifugér pladen kortvarigt og fjern forseglingen, tilsæt herefter Amount2.5 µL ReagentNeutralize Tagment BufferIllumina, Inc.Catalog #FC-131-1096 til hver brønd.

Brug en multikanalpipette indstillet på 10 µl til at blande hver prøve mindst 5 gange.
"Seal" pladen og centrifugér den ved Centrifigation280 x g, 20°C, 00:01:00 .
1m
Inkubér pladen i Duration00:05:00 stuetemperatur .
Fortsæt herefter med næste trin.
5m
PCR amplificering af biblioteker
PCR amplificering af biblioteker
4s
4s
Find følgende komponenter frem.

Komponenter opbevaret på frost:
ReagentIndex adaptersIllumina, Inc.Catalog #FC-131-2001 - FC-131-2004
- Optø ved stuetemperatur. (Rør) Vortex for at blande og centrifugér derefter ved Centrifigation12000 rpm, 00:00:15 . [Plader] Spin Duration00:00:30 før brug.
ReagentNextera PCR Master MixIllumina, Inc.Catalog #FC-131-1096
- Optø på is i 20 minutter.
45s
Tilsæt Amount7.5 µL ReagentNextera PCR Master MixIllumina, Inc.Catalog #FC-131-1096 til hver brønd i NTA-pladen.
"Seal" og centrifugér pladen i ~Duration00:00:04 .

4s
Tilsæt Amount2.5 µL fra den første Nxxx-indeks primer (orange propper) til hver brønd i den første kolonne på NTA-pladen. Gør derefter det samme med den anden indeks primer i den anden kolonne, og fortsæt til alle brønde har fået indeks (se Figur 1).
Smid den gamle prop ud og sæt en ny på (dette gøres for at forhindre kontaminering af primerrøret).

Figur 1: Oversigt over hvor de forskellige indeks adapterer skal tilsættes i NTA-pladen. Nxxx-indeks adapterer (orange propper) tilsættes kolonnevis, og Sxxx-indeks adapterer (hvide propper) tilsættes rækkevis.
Tilsæt Amount2.5 µL fra den første Sxxx-indeks primer (hvide propper) til hver brønd i den første række på NTA-pladen. Gør derefter det samme med den anden indeks primer i den anden række, og fortsæt til alle brønde har fået indeks (se Figur 1).
Smid den gamle prop ud og sæt en ny på (dette gøres for at forhindre kontaminering af primerrøret).
Bland indholdet i brøndene 3-5 gange med en multikanalpipette indstillet til 10 µL.
"Seal" pladen. Spin ned ved Centrifigation280 x g, 00:01:00 .
1m
Kør NTA-pladen på følgende PCR-program:

Temp.TidRunder
72°C03:001
95°C00:301
95°C00:1012
55°C00:30
72°C00:30
72°C05:001
10°C∞1
PCR-program

Sikkert stoppested
Hvis det ikke er planlagt at fortsætte direkte efter denne PCR, skal pladen enten blive i termocykleren ved 10 grader natten over eller opbevares i køleskabet i op til to dage.
Rengøring af PCR-produkter
Rengøring af PCR-produkter
1m
1m
Find følgende komponenter frem.

Komponenter opbevaret på frost/køl:
ReagentResuspension BufferIllumina, Inc.Catalog #FC-131-1096
- Tø op og bring til stuetemperatur. Vortex for at blande. "Resuspension Buffer" kan opbevares ved 2°C til 8°C efter den indledende optøning.

Komponenter opbevaret på køl:
ReagentAMPure XP beadsBeckman CoulterCatalog #A63881
- Lad stå ved stuetemperatur i 30 minutter. Vortex og vend for at blande.
Lav op til Amount50 mL Concentration80 % (v/v) ReagentEtOHContributed by users fra absolut ethanol - nok til 96 prøver.

Centrifugér NTA-pladen ved Centrifigation280 x g, 00:01:00 for at samle indholdet i bunden af brøndende.
1m
Vortex ReagentAMPure XP beadsBeckman CoulterCatalog #A63881 .
"Beads" skal have stuetemperatur, før der fortsættes.

Tilsæt Amount11.25 µL ReagentAMPure XP beadsBeckman CoulterCatalog #A63881 til hver brønd i NTA-pladen.

Bland forsigtigt hver brønd 10 gange (brug en multikanalpipette sat til 50 µL).
Inkubér NTA-pladen i Duration00:05:00 stuetemperatur .
5m
Placér pladen på en magnetisk holder i ~Duration00:02:00 - eller indtil supernatanten er helt klar.

2m
Lad NTA-pladen blive på den magnetiske holder.
Indstil en 200 µL multikanalpipette til 40 µL, fjern forsigtigt supernatanten og kassér den.
VIGTIGT: Undgå at forstyrre pellet. Hvis pellet forstyrres skal supernatanten pipetteres tilbage i brøndene og stå i yderligere 2 minutter.
Vask prøverne to gange på følgende måde:
Imens NTA-pladen bliver på den magnetiske holder tilsættes Amount200 µL friskblandet Concentration80 % (v/v) ReagentEtOHContributed by users - bland ikke prøverne.

Inkubér prøverne i Duration00:00:30 .

30s
Fjern og kassér supernatanten uden at forstyrre pellet.
(Efter 1. vask Go togo to step #28.1 )
Brug en 10 µL multikanalpipette til at fjerne de sidste rester af EtOH fra brøndene - vær stadig forsigtig med ikke at forstyrre pelleten.
Lad NTA-pladen stå på den magnetiske holder i Duration00:15:00 for at lufttørre pelleten.

15m
Fjern NTA-pladen fra den magnetiske holder og tilsæt Amount22 µL ReagentResuspension BufferIllumina, Inc.Catalog #FC-131-1096 til hver brønd.

Bland forsigtigt 10 gange med en multikanalpipette.
Inkubér pladen i Duration00:05:00 stuetemperatur .
Anbring derefter pladen på den magnetiske holder i Duration00:05:00 indtil supernatanten er helt klar.

10m
Navngiv en ny plade "CAN" (Clean Amplified Plate) + et unik ID.
Overfør Amount20 µL supernatant fra NTA-pladen til den nye CAN-plade.


Note
Hvis der er spor af "AMPure beads" i suspensionen (ses typisk som en svag farvning af supernatanten), pipetteres denne tilbage og inkuberes i yderligere Duration00:02:00 på magnet holderen. NTA-pladen kan kasseres efter en vellykket overførsel af supernatanten.

Sikkert stoppested
Hvis det ikke er planlagt at fortsætte direkte, kan CAN-pladen opbevares ved -15 til -25˚C i op til 1 uge, ellers fortsæt til trin 37.
Bestem DNA-koncentrationen i CAN-pladen med et
Equipment
Qubit 4
NAME
Fluorometer
TYPE
Invitrogen
BRAND
Q33238
SKU
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33238
LINK
med et ReagentQubit™ 1X dsDNA HS Assay KitInvitrogen - Thermo FisherCatalog #Q33231 (mål på 2 µL).

Note
Hvordan man måler på Qubit (Amount2 µL prøve)
  • Tag et antal Qubit-rør (Invitrogen - Thermo Fisher #Q32856) frem matchende antallet af prøver + 2 mere til standarder.
  • Pipettér følgende volumener af "working solution" til de to typer af rør: Amount198 µL til alle prøverør samt Amount190 µL til de to rør til standarder.
  • Tilføj Amount10 µL af hhv. standard #1 og #2 til hvert sit rør til standarderne med "working solution" (den totale volumen skal være 200µL).
  • Tilføj Amount2 µL fra hver prøve til hvert sit prøverør med "working solution" (den totale volumen skal være 200µL).
  • Vortex alle rør og inkubér dem i Duration00:02:00 ved stuetemperatur. Tjek at der ikke er nogle bobler i væsken.
  • Fra forsiden på instrumentet vælg dsDNA og derefter 1x dsDNA High Sensitivity.
  • Vælg Read Standards og følg anvisningerne.
  • Efter begge standarder er målt, vælg Run samples og sørg for at "original sample volume" er sat til 2µL, samt at "output sample units" er sat til ng/µL.
  • Sæt den første prøve i instrumentet og vælg Read tube. Notér koncentrationen.
  • Forsæt med de resterende prøver.

Normalisering og "final pool"
Normalisering og "final pool"
Under normaliseringen beregnes der, hvor meget der skal overføres fra hver enkelte prøve til en "final pool", således at hver prøve sekventeres med tilstrækkelig dybde.
Det gøres ved hjælp af et excel-ark hvor beregningerne er "automatiseret" og tager forhold til bakteriernes gns. genom størrelse og prøve koncentrationerne samt den ønskede slutkoncentration og slutvolumen på "final pool".

Download og benyt følgende excel-ark:
Download Normalisering og final pool - SSI.xlsxNormalisering og final pool - SSI.xlsx32KB

Under Trin 1 indtastes:
- Batch navn
- Navn på eksperiment
- Dato for det udførte arbejde
- Laboranten der udfører arbejdet
Under Trin 2 indtastes for hver prøve, ud for den rette brøndposition:
- Prøve ID
- Organismens latinske navn

Den tilhørende genom størrelse tilføjes automatisk baseret på organismens navn.
Under Trin 3 indtastes:
- Den ønskede slutkoncentration (i nM) for "final pool"
(i denne protokol er den sat til Concentration4 nanomolar (nM) ).
- Den ønskede "pooling" volumen (i uL) for "final pool"
(i denne protokol er den sat til Amount300 µL ).

Under Trin 4 indtastes:
- De målte koncentrationer for prøverne i ng/uL (blå kolonne)

Værdierne i de efterfølgende kolonner udregnes automatisk.
Hvis en prøve har en koncentration < 1 ng/uL, er koncentrationen for lav.
I det/de tilfælde skal den tilhørende værdi i kolonne x grr (rød kolonne) ændres til '0'. Hvilket fjerner prøven fra de videre beregninger, og der bliver ikke overført noget fra prøven til den endelige "final pool".
Overfør for hver prøve den tilhørende beregnede volumen angivet i kolonnen uL fra prøve til "final pool" (grøn kolonne) til et nyt 1,5 mL rør.
Dette er "final pool".

Note
Der er kun 18 uL tilbage af hver prøve i CAN-pladen (efter Qubit-målingen).
Hvis der skal bruges mere end 18 uL - prøv at sænke den ønskede slutvolumen for "final pool".

Note
Hvis der er spor af "AMPure beads" i "final pool", kan røret sættes på en magnetholder i ~Duration00:05:00 , eller indtil væsken er klar, hvorefter hele volumen (uden "beads") kan overføres til et nyt 1,5 mL rør.

For at være sikker på at "final pool" har den ønskede molær slutkoncentration, lav endnu en koncentrationsbestemmelse på følgende måde:
Bestem DNA-koncentrationen i "final pool" med et Qubit fluorometer (se trin 37).
Bestem den gns. fragmentstørrelse i "final pool" - f.eks. på en
Equipment
4200 TapeStation System
NAME
Automated electrophoresis platform
TYPE
Agilent
BRAND
G2991BA
SKU
https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/tapestation-systems/tapestation-instruments/4200-tapestation-system-228263
LINK
med følgende komponenter:
ReagentD5000 ScreenTapeAgilent TechnologiesCatalog #5067-5588 ReagentD5000 ReagentsAgilent TechnologiesCatalog #5067-5589

Note
Se under References for en "quick guide" til Tapestation D5000 screen tapes.

Fordelen ved at bestemme den gns. fragmentstørrelse er:
- Det er muligt visuelt at se, om der er noget galt med biblioteket, inden der fortsættes til sekventeringen.

Åben excel-arket: Normalisering og final pool - SSI.

Under Trin 5 indtastes:
- DNA-koncentrationen i "final pool" (i ng/µL)
- Den gns. fragmentstørrelse i "final pool" (i bp)

Den reelle molær slutkoncentration udregnes automatisk, samt om det er nødvendigt at fortynde "final pool" yderligere.
Hvis det er nødvendigt, fortynd "final pool" med ReagentResuspension BufferIllumina, Inc.Catalog #FC-131-1096 som nævnt under Trin 5.
Sekventering
Sekventering
Find følgende reagenser frem.

Opbevares ved stuetemperatur:
Reagent10 mM Tris-Cl pH 8.5 with 0.1% Tween-20TeknovaCatalog #T7724

Opbevares på køl:
Reagent1 M NaOHContributed by users
ReagentPR2 - Incorporation BufferIllumina, Inc.Catalog #MS-102-2003
ReagentMiSeq 500 cycle Kit v2 - Flow CellIllumina, Inc.Catalog #MS-102-2003

Opbevares på frost:
ReagentPhiX Control v3Illumina, Inc.Catalog #FC-110-3001
ReagentHT1 - Hybridization BufferIllumina, Inc.Catalog #MS-102-2003
- Stil på is når det er tøet op.
ReagentMiSeq 500 cycle Kit v2 - Reagent CartridgeIllumina, Inc.Catalog #MS-102-2003
- Kan sættes på køl dagen før for at tø.


Note
Det er også muligt at sekventere biblioteket på en NextSeq 500/550 med et NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2.5 (300 Cycles). Men dette vil ikke blive dækket i denne protokol.

Denaturering og fortynding af bibliotek
Denaturering og fortynding af bibliotek
Lav en frisk Concentration0.2 Molarity (M) fortynding af NaOH.
I et eppendorfrør blandes Amount400 µL ReagentNuclease-free Water med Amount100 µL Reagent1 M NaOH .
Vortex kort.
Overfør Amount5 µL fra "final pool" til et nyt 1,5 mL rør.
Tilsæt Amount5 µL 0.2 M NaOH.
Vortex og centrifugér ved Centrifigation280 x g, 00:01:00 .
1m
Inkubér i Duration00:05:00 stuetemperatur .
5m
Tilsæt Amount990 µL afkølet ReagentHT1 - Hybridization BufferIllumina, Inc.Catalog #MS-102-2003 til røret (koncentrationen er nu Concentration20 picomolar (pM) ).
Vortex og centrifugér kortvarigt.
Sæt røret på is.
Fortynd til Concentration10 picomolar (pM) i et nyt 1,5 mL rør ved at blande Amount300 µL Concentration20 picomolar (pM) denatureret bibliotek med Amount300 µL afkølet ReagentHT1 - Hybridization BufferIllumina, Inc.Catalog #MS-102-2003 .
Vend røret et par gange og centrifugér kortvarigt.
Sæt røret på is.
Hvis det ønskes at tilsætte en PhiX kontrol til det denatureret bibliotek inden sekventeringen - fortsæt til trin 52.

Hvis det ikke ønskes at tilsætte en PhiX kontrol - gå til trin 61.
I et 1,5 mL rør, miks Amount2 µL Concentration10 nanomolar (nM) ReagentPhiX Control v3Illumina, Inc.Catalog #FC-110-3001 med Amount3 µL Reagent10 mM Tris-Cl pH 8.5 with 0.1% Tween-20TeknovaCatalog #T7724
Tilsæt Amount5 µL Concentration0.2 Molarity (M) NaOH til røret.
Vortex og centrifugér ved Centrifigation280 x g, 00:01:00 .
1m
Inkubér i Duration00:05:00 stuetemperatur .
5m
Tilsæt Amount990 µL afkølet ReagentHT1 - Hybridization BufferIllumina, Inc.Catalog #MS-102-2003 til røret (koncentrationen er nu Concentration20 picomolar (pM) ).

Note
Den Concentration20 picomolar (pM) denatureret PhiX kontrol kan opbevares på Temperature-20 °C op til 3 uger.


Overfør Amount375 µL Concentration20 picomolar (pM) PhiX kontrol til et nyt 1,5 mL rør.
Tilsæt Amount225 µL afkølet ReagentHT1 - Hybridization BufferIllumina, Inc.Catalog #MS-102-2003 til røret (koncentrationen er nu Concentration12.5 picomolar (pM) ).
Fjern Amount6 µL fra det Concentration10 picomolar (pM) denatureret bibliotek (prøverne).

Tilsæt Amount6 µL Concentration12.5 picomolar (pM) PhiX kontrol til det denatureret bibliotek (prøverne).

Vend røret et par gange og centrifugér kortvarigt.
Sæt røret på is.
MiSeq kørsel
MiSeq kørsel

Safety information
ReagentMiSeq 500 cycle Kit v2 - Reagent CartridgeIllumina, Inc.Catalog #MS-102-2003 indeholder N,N-Dimethylformamid (position 8 i kasetten).
Kronisk sundhedsfare
Sundhedsfare
Arbejd med korrekt personbeskyttelse (kittel, briller og handsker med høj gennembrudstid).

Vend ReagentMiSeq 500 cycle Kit v2 - Reagent CartridgeIllumina, Inc.Catalog #MS-102-2003 ti gange og ReagentPR2 - Incorporation BufferIllumina, Inc.Catalog #MS-102-2003 fem gange for at blande reagenserne.

Sikre at alle reagenser er tøet op, er blandet og at der ikke er luftbobler i bunden af de forskellige reservoir.
På ReagentMiSeq 500 cycle Kit v2 - Reagent CartridgeIllumina, Inc.Catalog #MS-102-2003 , prik hul i folieforseglingen ved det markerede reservoir "Load Samples" med en ren 1 mL pipettespids.
Overfør hele Concentration10 picomolar (pM) prøve biblioteket til reservoiret.
Undgå at røre ved folieforseglingen.
Tryk på Sequence på skærmen af
Equipment
MiSeq
NAME
Sequencer
TYPE
illumina
BRAND
SY-410-1003
SKU
https://www.illumina.com/systems/sequencing-platforms/miseq/order-miseq.html
LINK

Vælg én af tre "setup" muligheder:
Local Run Manager

Note
På forhånd klargøres kørslen ("Create run") i Local Run Manger (LRM) med de ønskede indstillinger og prøveinformationer.
I denne protokol vælges der paired end,
og
Index 1 og Index 2 sættes til 8,
Read 1 og Read 2 sættes til 251.

LRM åbnes enten fra skrivebordet på instrumentet, ved at åbne chromium eller ved at åbne og logge ind på LRM fra en arbejdscomputer, hvis computer og instrument er på samme netværk.
Se Local Run Manager Off-Instrument Software Guide (1000000011909) for hjælp til den sidste mulighed.
https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/software_documentation/local-run-manager/local-run-manager-off-instrument-software-guide-1000000011909-00.pdf

Vælg det ønskede "run" fra listen med klargjorte kørsler.

Tryk på Next.
Sample Sheet

Note
På forhånd udfyldes et "sample sheet" med alle de ønskede indstillinger og prøveinformationer.
I denne protokol køres der med paired end,
og
Read 1 og Read 2 sættes til 251.
Index 1 og Index 2 indstilles automatisk til 8, når "sample sheet" uploades på instrumentet.

Eksempel på "sample sheet": Download Eksempel på MiSeq Sample sheet.xlsxEksempel på MiSeq Sample sheet.xlsx12KB .
Noter:
- Grønne områder omkranset af '<...>' skal udfyldes/ændres med de ønskede informationer.
- "Sample Sheet" skal gemmes som .csv-fil. Ellers accepterer instrumentet ikke filen.

"Browse" og vælg det klargjorte "sample sheet".

Tryk på Next.
Manual

Vælg paired end .

Indtast følgende informationer:
Index 1 og Index 2 sættes til 8,
Read 1 og Read 2 sættes til 251.

Vælg den ønskede "output folder".

"Browse" og vælg det klargjorte "sample sheet" (skal indeholde prøve ID og index' på alle prøverne).
Se trin 65.2 for en skabelon til et "sample sheet".

Tryk på Next.
Inden ReagentMiSeq 500 cycle Kit v2 - Flow CellIllumina, Inc.Catalog #MS-102-2003 sættes i instrumentet.

Skyl flow cellen grundigt men forsigtigt med ReagentMilliQ waterContributed by users for at skylle buffer og eventuelle saltrester af flow cellen.
Tør forsigtigt men grundigt flow cellen med fnugfri linse renseservietter.
Vær meget forsigtig omkring de sorte flow celle porte samt glasset på flow cellen.
Skyl glasset på flow cellen med Concentration70 % (v/v) ReagentEtOHContributed by users (undgå at ramme de sorte porte), og tør det forsigtigt af igen med fnugfri linse renseservietter (der kan gemme sig meget i revnerne på flow cellen).

Vær sikker på at glasset er fri for striber, fingeraftryk, fnug og fibre.
Hold på kanterne af flow cellen uden at røre ved glasset.

Placér flow cellen i instrumentet som ansvist på skærmen.

Tryk på Next.
Åben lågen under skærmen.
Løft håndtaget til de to "sipper", som anvist på skærmen, indtil det låser på plads.
(Håndtaget er placeret imellem de to flasker)
Fjern den gamle flaske med buffer (står i midten) og tøm affaldsbeholderen (står til højre).
Fjern låget fra ReagentPR2 - Incorporation BufferIllumina, Inc.Catalog #MS-102-2003 .

Indsæt ReagentPR2 - Incorporation BufferIllumina, Inc.Catalog #MS-102-2003 og den tomme affaldsbeholder på deres rette position som anvist på skærmen.

Sænk langsomt håndtaget til de to "sipper".
Sørg for at de to "sipper" sænkes ned i ReagentPR2 - Incorporation BufferIllumina, Inc.Catalog #MS-102-2003 og affaldsbeholderen.

Tryk på Next.
Åben lågen til kølerummet (til venstre).
Fjern den gamle vaskekassette.
Hold ReagentMiSeq 500 cycle Kit v2 - Reagent CartridgeIllumina, Inc.Catalog #MS-102-2003 i håndtaget i bagenden af kassetten ved Illumina mærket og skub den ind i kølerummet indtil den stopper.

Luk lågen til kølerummet.
Tryk på Next.
Tjek at "run parameters" passer og tryk på Next.
Når instrumentet er færdig med sit "pre-run check", tryk på Start Run.

Hvis "Start run after pre-run check" er valgt til under kørselsindstillingerne, begynder kørslen automatisk, når instrumentet er færdig med sit "pre-run check".
Hvor lang tid tager kørslen?
Hvor lang tid tager kørslen?
En kørsel med en ReagentMiSeq 500 cycle Kit v2 - Reagent CartridgeIllumina, Inc.Catalog #MS-102-2003 tager ~39 timer.

Protocol references