Jun 10, 2024
Análise filogenômica
- 1Universidade Federal do Sul da Bahia
Protocol Citation: Thiago Mafra Batista 2024. Análise filogenômica. protocols.io https://dx.doi.org/10.17504/protocols.io.q26g71mb1gwz/v1
License: This is an open access protocol distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited
Protocol status: In development
We are still developing and optimizing this protocol
Created: June 07, 2024
Last Modified: June 10, 2024
Protocol Integer ID: 101431
Keywords: phylogenomics, IQTREE2, BUSCO
Abstract
This tutorial will guide students and researchers in constructing phylogenetic trees from genomic data. The step-by-step process includes data acquisition, assessment of genome completeness, identification of complete and single-copy orthologs present in the genomes, followed by alignment and trimming of the alignment. Phylogenetic inference will be performed using IQ-TREE2, and finally, the tree will be visualized and edited in iTOL.
Materials
Softwares utilizados neste tutorial:
1. BUSCO (https://busco.ezlab.org/)
Scripts acessórios:
- genbank_assembly_downloader.py (https://github.com/thiagomaframg/bioinfo/blob/main/genbank_assembly_downloader.py)
Aquisição dos genomas no formato fasta
Aquisição dos genomas no formato fasta
A primeira etapa da construção da árvore filogenômica consiste em baixar os genomas que serão analisados. Para isso, é necessário visitar a pagina Genome do NCBI no link https://www.ncbi.nlm.nih.gov/datasets/genome/. Digite o nome das espécies de interesse e anote, em uma tabela ou planilha, os respectivos nomes e os identificadores do Genbank, que começam com GCA_. Essa tabela ou planilha será fornecida como material suplementar do artigo. Obs: lembre-se de incluir o genoma do outgroup da árvore.
Após anotar os identificadores de todos os genomas, copie e cole apenas os identificadores em um arquivo chamado accessions.txt. Um identificador por linha.
Feito isso, vamos rodar o script genbank_assembly_downloader.py para baixar os genomas cujo identificador está presente no arquivo accessions.txt
python genbank_assembly_downloader.py
O script irá criar um diretório chamado downloads e dentro dele serão salvos todos os arquivos fasta correspondentes a cada genoma. Os arquivos serão nomeados com seus respectivos códigos. Sugiro renomear estes arquivos com o nome das espécies como no exemplo:
mv GCA_030450195.1_ASM3045019v1_genomic.fna Saccharomycopsis_praedatoria_UFMG-CM-Y6991_genomic.fna
Avaliação da Completude dos genomas
Avaliação da Completude dos genomas
A construção da árvore será feita a partir do alinhamento múltiplo de todas as proteínas ortólogas de cópia simples (single-copies or 1:1) presentes em todos os genomas. Para identificá-las vamos utilizar o software BUSCO. Vamos rodá-lo de forma automatizada, com o script busco_run.py.
Será necessário editar o script para ajustá-lo à sua realidade. Parâmetros como busco_lineage, download_path, output_dir e --cpu. Considerando que todos os arquivos fasta dos genomas estão no diretório atual de trabalho, rode:
python busco_run.py
Será criado um diretório de output contendo todos os resultados de todos os genomas. Cada diretório terá o nome das duas primeiras palavras dos arquivos fasta dos genomas. Exemplo: diretório Saccharomycops_praedatoria. Dentro de cada diretório contem um arquivo que começa com short_summary.specific*.txt. Precisamos destes arquivos.
mkdir busco_plot
Agora copie todos os arquivos short_summary.specific*.txt para este diretório:
cp busco_outputs/*/short_summary.specific*.txt busco_plot
Vamos usar este diretório para criar uma imagem com todos os resultados com um script acessário do BUSCO chamado generate_plot.py. Esta imagem nos ajudará a avaliar a completude dos genomas e a decidir se é necessário excluir da análise aqueles que apresentam baixa completude.
$BUSCO/scripts/generate_plot.py -wd busco_plot/
Abaixo um exemplo deste resultado:
No exemplo acima, todos os genomas apresentam boa completude, embora Barnettozyma salicaria tenha mais ortólogos ausentes. Não é necessário excluir nenhum genoma da análise. Vamos seguir para a próxima etapa.
Identificação dos ortólogos 1:1 presentes em todos os genomas
Identificação dos ortólogos 1:1 presentes em todos os genomas
Agora que já temos a avaliação da completude de todos os genomas, vamos identificar quais são os ortólogos de cópia única (single-copies ou 1:1) presentes nos genomas. Para isso vamos utilizar o script BUSCO_phylogenomics.py. Este script identifica proteínas BUSCO que são completas e de cópia única em todas as amostras de entrada. Alternativamente, é possível considerar os dados ausentes e optar por incluir proteínas BUSCO que sejam completas e de cópia única em uma determinada porcentagem dos genomas. Cada família BUSCO é individualmente alinhada, aparada e depois concatenada para gerar um alinhamento de supermatriz.
python ~/bin/BUSCO_phylogenomics/BUSCO_phylogenomics.py -i busco_run/ -o busco_phylo -t 48 --supermatrix --gene_tree_program iqtree
Dentro do diretório chamado busco_phylo serão salvos os arquivos necessários para a construção da árvore filogenômica.
Construção da árvore filogenômica
Construção da árvore filogenômica
Agora temos os arquivos prontos para a inferência filogenética. O arquivo de input para o iqtree2 será o SUPERMATRIX.phylip
Sugiro que seja utilizado o screen ou tmux para rodar o iqtree2.
screen iqtree2 -s SUPERMATRIX.phylip -p SUPERMATRIX.partitions.nex -m TESTMERGE --rclusterf 10 -B 1000 --sampling GENE -T AUTO
Serão gerados diversos arquivos de output. O principal arquivo será o SUPERMATRIX.partitions.nex.treefile