Jun 10, 2024
Análise de metabarcoding de DNA
- 1Universidade Federal do Sul da Bahia
Protocol Citation: Thiago Mafra Batista 2024. Análise de metabarcoding de DNA. protocols.io https://dx.doi.org/10.17504/protocols.io.yxmvme9k5g3p/v1
License: This is an open access protocol distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited
Protocol status: Working
We use this protocol and it's working
Created: June 09, 2024
Last Modified: June 10, 2024
Protocol Integer ID: 101460
Keywords: 16SV3V4, metabarcoding, bioinformatics, metagenomics, usearch, mapseq
Abstract
Este tutorial conduzirá estudantes e pesquisadores a realizarem análise metataxonômica de microrganismos a partir da amplificação das regiões V3V4 do gene 16S ribossomal. Iniciando pela união dos pares de reads com usearch, em seguida, usamos o cutadapt para cortar os primers das sequências. Depois, realizamos a filtragem de qualidade com usearch, encontramos sequências únicas e abundantes, e criamos clusters de OTUs (Operational Taxonomic Units) com 97% de similaridade. Em seguida, utilizamos o mapseq para mapear as OTUs contra um banco de dados. Por fim, criamos tabelas de OTUs para cada amostra e geramos um arquivo HTML para visualização dos resultados com o Krona.
Materials
Softwares necessários para toda pipeline:
- R
- awk
Os scripts acessórios estão com link do github disponível no tutorial.
Análise da qualidade das reads
Análise da qualidade das reads
Vamos avaliar o perfil de qualidade das reads com o software FastQC.
$ fastq -t 64 *.fastq -o .
União dos pares de reads
União dos pares de reads
Cada par de leitura é oriunda de um fragmento de amplicon sequenciado. Este fragmento precisa ser reconstruído. O parâmetro -fastq_mergepairs do usearch faz isso. Troque "{AMOSTRAS}" por um código único de sua escolha.
$ usearch -fastq_mergepairs *1.fq -reverse *2.fq -fastq_maxdiffs 6 -fastqout {AMOSTRAS}_merged.fq -relabel @ 2>> {AMOSTRAS}_merged.log
Remoção dos primers
Remoção dos primers
As sequências dos primers também são sequenciadas e precisamos removê-las da reads, agora, unidas. Vamos utilizar o cutadapt e as sequências dos primers forward (parâmetro -g) e reverse (parâmetro -a).
$ cutadapt -g TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG {AMOSTRA}_merged.fq --discard-untrimmed 2>>{AMOSTRA}_cut.log | cutadapt -a GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC -o {AMOSTRA}_merged_cut.fq --discard-untrimmed - 1>>{AMOSTRA}_cut.log
Descarte de reads com erros
Descarte de reads com erros
Vamos agora descartar reads que provavelmente possuem erros, tanto nas sequencias que tiveram primers removidos, quanto nas sequencias sem primers identificados.
$ usearch -fastq_filter {AMOSTRA}_merged_cut.fq -fastq_maxee 1.0 -fastaout {AMOSTRA}_filtered.fa -relabel Filt
$ usearch -fastq_filter {AMOSTRA}_merged.fq -fastq_maxee 1.0 -fastaout {AMOSTRA}_filtered.fa -relabel Filt 2>>{AMOSTRA}_filter.log
Sequências únicas e abundantes
Sequências únicas e abundantes
Agora vamos encontrar as sequências únicas e abundantes com o parâmetro -fastx_uniques
$ usearch -fastx_uniques {AMOSTRA}_filtered.fa -fastaout {AMOSTRA}_uniques.fa -sizeout -relabel Uniq 2>>{AMOSTRA}_uniques.log
Clusters de OTUs
Clusters de OTUs
Agora vamos agrupar as sequências únicas e abundantes de acordo com a identidade entre elas, considerando 97% de similaridade.
$ usearch -cluster_otus {AMOSTRA}_uniques.fa -relabel {AMOSTRA}_OTU -otus {AMOSTRA}_otus.fa 2>>{AMOSTRA}_otus.log
Tabelas de OTUs
Tabelas de OTUs
Agora vamos criar uma tabela contendo as informações de OTUs:
$ usearch -otutab {AMOSTRA}_merged.fq -otus {AMOSTRA}_otus.fa -strand plus -otutabout {AMOSTRA}_otutab.txt 2>>{AMOSTRA}_otutab.log
Plotar a curva de rarefação da diversidade alfa
Plotar a curva de rarefação da diversidade alfa
Vamos analisar a diversidade alfa a partir da curva de rarefação. Para isso vamos utilizar o script rare.R.
$ Rscript rare.R ${AMOSTRA}_otutab.txt
Mapear as OTUs contra um banco de dados
Mapear as OTUs contra um banco de dados
Com o mapseq vamos fazer blast das OTUs contra um banco de dados. No exemplo a seguir, utilizamos 24 processadores
$ mapseq -nthreads 24 {AMOSTRA}_otus.fa >{AMOSTRA}_otus.mapseq 2>>{AMOSTRA}_otus.mapseq.log
Criar tabelas de OTUs para cada amostra
Criar tabelas de OTUs para cada amostra
Vamos criar uma tabela que irá conter as informações do mapeamento de cada amostra a partir do resultado do mapseq. Vamos usar um loop para otimizar a execução do awk.
for i in {2..13}
do
awk -F"\t" '{print $1,"\t",$'"$i"'}' {AMOSTRA}_otutab.txt | sed 's/ //g' > "C${i}G$(($i+1))_otutab.txt"
done
Concatenar as tabelas geradas com usearch e mapseq
Concatenar as tabelas geradas com usearch e mapseq
Vamos unir as tabelas geradas pelo usearch e pelo mapseq para serem visualizadas no krona. Vamos utilizar o script em perl concat_OTUs_Taxons.pl.
for i in {2..13}
do
concat_OTUs_Taxons.pl "C${i}G$(($i+1))_otutab.txt" {AMOSTRA}_otus.mapseq > "C${i}G$(($i+1))_results.txt"
done
$ ktImportText C*_results.txt -o ${AMOSTRA}_results.html
Resultado da análise de metabarcoding de DNA1 step
Este é um exemplo de resultado gerado por essa análise. Cada amostra está representada em um gráfico de pizza com seus respectivos percentuais de abundância. Os 7 níveis de classificação taxonômica são mostrados.
16SV34_results.html
628KB
Script para otimização da análise
Script para otimização da análise
#!/bin/bash
# Este script realiza uma análise metataxonômica da região 16S V3V4
echo "\nAnálise metataxonômica 16S regiões V3V4 Iniciada"
# Variáveis e parâmetros
AMOSTRA="16SV34"
usearch="usearch" # Especificar caminho completo se necessário
primer5="TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG" # Primer forward
primer3="GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC" # Primer reverse
# Unir pares
echo "\nUNINDO OS PARES"
$usearch -fastq_mergepairs *1.fq -reverse *2.fq -fastq_maxdiffs 6 -fastqout ${AMOSTRA}_merged.fq -relabel @ 2>> ${AMOSTRA}_merged.log
echo "UNIÃO CONCLUÍDA"
# Remover primers
echo "\nCUTADAPT"
# Cortando os primers e mantendo apenas as reads que foram cortadas
cutadapt -g "$primer5" ${AMOSTRA}_merged.fq --discard-untrimmed 2>>${AMOSTRA}_cut.log | cutadapt -a "$primer3" -o ${AMOSTRA}_merged_cut.fq --discard-untrimmed - 1>>${AMOSTRA}_cut.log
echo "CUTADAPT CONCLUÍDO"
# Descartar reads com erros
echo "\nDESCARTANDO READS COM ERROS"
# Quality filtering: descartar reads que provavelmente possuem erros
$usearch -fastq_filter ${AMOSTRA}_merged_cut.fq -fastq_maxee 1.0 -fastaout ${AMOSTRA}_filtered.fa -relabel Filt 2>>${AMOSTRA}_filter.log
echo "DESCARTE CONCLUÍDO"
# Encontrar sequências únicas e abundantes
echo "\nENCONTRAR ÚNICAS E ABUNDANTES"
$usearch -fastx_uniques ${AMOSTRA}_filtered.fa -fastaout ${AMOSTRA}_uniques.fa -sizeout -relabel Uniq 2>>${AMOSTRA}_uniques.log
# Criar clusters de OTUs com 97% de similaridade
echo "\nCRIAR CLUSTERS DE OTUs COM 97% DE SIMILARIDADE"
$usearch -cluster_otus ${AMOSTRA}_uniques.fa -relabel ${AMOSTRA}_OTU -otus ${AMOSTRA}_otus.fa 2>>${AMOSTRA}_otus.log
# Criar tabelas de OTUs
echo "\nCRIAR TABELAS COM OS OTUs"
$usearch -otutab ${AMOSTRA}_merged.fq -otus ${AMOSTRA}_otus.fa -strand plus -otutabout ${AMOSTRA}_otutab.txt 2>>${AMOSTRA}_otutab.log
# Criar e plotar a tabela de diversidade alfa (opcional)
#echo "\nCRIAR E PLOTAR A TABELA DE DIVERSIDADE ALFA"
#Rscript /home/ufsb/bin/rare.R ${AMOSTRA}_otutab.txt
# Mapear as OTUs contra banco de dados
echo "\nMAPEAR AS OTUs CONTRA BANCO DE DADOS"
mapseq -nthreads 8 ${AMOSTRA}_otus.fa > ${AMOSTRA}_otus.mapseq 2>>${AMOSTRA}_otus.mapseq.log
# Criar a tabela de OTUs para cada amostra
echo "\nCRIAR A TABELA DE OTUs PARA CADA AMOSTRA"
for i in {2..13}
do
awk -F"\t" '{print $1,"\t",$'"$i"'}' ${AMOSTRA}_otutab.txt | sed 's/ //g' > "C${i}G$(($i+1))_otutab.txt"
done
# Unir as tabelas geradas pelo usearch e mapseq para abrir no Krona
echo "\nUNIR AS TABELAS GERADAS PELO USEARCH E MAPSEQ PARA ABRIR NO KRONA"
for i in {2..13}
do
concat_OTUs_Taxons.pl "C${i}G$(($i+1))_otutab.txt" ${AMOSTRA}_otus.mapseq > "C${i}G$(($i+1))_results.txt"
done
# Criar um arquivo HTML para visualização dos resultados
echo "\nCRIAR UM ARQUIVO HTML PARA VISUALIZAÇÃO DOS RESULTADOS"
ktImportText C*_results.txt -o ${AMOSTRA}_results.html
echo "\nANÁLISE 16SV3V4 FINALIZADA""