Apr 10, 2018
Aislamiento de Paenibacillus sp. desde muestras ambientales
- 1Pontificia Universidad Catolica de Chile;
- 2SynBioUC
- Laboratorio de Tecnologias Libres
Protocol Citation: Daniel D.A.N Núñez, Tamara Matute, Isaac Núñez, Fernan Federici 2018. Aislamiento de Paenibacillus sp. desde muestras ambientales. protocols.io https://dx.doi.org/10.17504/protocols.io.nwadfae
License: This is an open access protocol distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited
Protocol status: Working
We use this protocol in our group and it is working (after some cycles of testing and optimization)
Created: March 17, 2018
Last Modified: April 10, 2018
Protocol Integer ID: 10914
Keywords: Paenibacillus, bacterial isolation, low cost method
Abstract
Este protocolo describe como aislar bacterias mótiles del género Paenibacillus a partir de muestras ambientales. El protocolo no involucra material de laboratorio especializado.
Parte del proyecto Comunicaciones Especulativas:
datos en https://osf.io/c542q/wiki/home/
codigo en https://github.com/interspecifics/ComunicacionesEspeculativas
info en http://interspecifics.cc/comunicacionesespeculativas/
Guidelines
Paenibacillus sp. es una bacteria mótil presente comunmente en el suelo. De esta forma puede ser colectada a partir de muestras de tierra, suelo, polvo, pelos de animales, etc.
Su identificación puede ser realizada simplemente por inspección visual, por lo que no es necesario utilizar antibióticos ni tinciones especializadas.
Safety warnings
Paenibacillus sp. en general no está descrita como un patógeno humano, por lo que no debería representar un peligro para la salud. No obstante, debido a que las muestras provienen del ambiente y poseen microorganismos no determinados, es importante manipular los cultivos con cuidado y manejar los desechos de forma responsable.
Before start
Antes de realizar la recolección se deben tener preparados los contenedos limpios o placas de LB 1.5% agar (en caso de plaqueo directo).Además, se debe tener preparado y autoclavado el glicerol 50% antes de preprar los stock criogénicos.
Recolección y preparación de muestras ambientales.
Recolección y preparación de muestras ambientales.
Opción 1: Colectar y almacenar las muestras en un contenedor limpio.
Opción 2: Tocar la muestra con un asa limpia y pasar directamente al paso 3.
Opción 3: Colocar la muestra directamente en una placa de LB 1,5% y saltarse hasta el paso 4.
Note
Las muestras a colectar deben involucrar polvo o tierra. De esta manera puede tomarse directamente un par de gramos de tierra del lugar de interés, muestras de pelo de animales/plantas o polvo desde superficies. Éstas deben ser depositadas en un contenedor limpio.
Disolución
Disolución
En tubos de 1,5 ml disolver las muestras de tierra en agua destilada siguiendo una relación (aproximadamente). Este paso es importante para que la muestra sea diluida y no afecte la composición del medio.
Note
Si la muestra no se puede disolver (e.g. piedras), ésta debe ser mezclada con agua y luego agitada.
Expected result
Cultivo
Cultivo
Sellado de placas
Sellado de placas
Sellar la placa con parafilm.
Incubación
Incubación
Incubar a temperatura ambiente. Es recomendable dejar la placa siempre boca abajo a modo de prevenir la condensación en la tapa y posterior goteo sobre el cultivo.
Selección y aislamiento
Selección y aislamiento
Realizar una inspección visual del cultivo diariamente.
Note
Las placas deben ser revisadas diariamente hasta observar colonias bacterianas con rastros de movimiento.
Expected result
Las bacterias deberían aparecen en un plazo de 1 día a 1 semana.
Expected result
Re-plaqueo de colonias positivas
Re-plaqueo de colonias positivas
Picar colonias identificadas y re-strikear en nueva placa.
Note
Seleccionar y picar con un asa las colonias identificadas, re-strikeando cada una de ellas en una placa de LB agar 1.5% nueva.
Sellado y re cultivo
Sellado y re cultivo
Sellar placas e Incubar a temperatura ambiente.
Repetir pasos 5 al 8 hasta observar cultivos homogéneos en las placas.
Expected result
Preparación de stock de glicerol
Preparación de stock de glicerol
Seleccionar una colonia aislada e inocular en 5 ml de LB líquido.
Note
Con la ayuda de un asa se debe picar la colonia seleccionada e introducirla en el medio de cultivo ( 5 ml de LB en tubo bacteriano).
Cultivo líquido
Cultivo líquido
Cultivar colonias a 37°C con agitación (250 RPM) durante 24h.
Note
De no contar con shaker termoregulado, dejar cultivo a temperatura ambiente hasta que se vuelva turbio (24 -48 h)
Guardar stock de glicerol (25%) a -25°C o -80 °C.
Note
En esterilidad, tomar 500 μl de cultivo y mezclar con 500 μl de glicerol 50% en un tubo criogénico y almacenar a -25°C o -80°C. Concentración final del stock será glicerol 25%.